干細(xì)胞治療子宮內(nèi)膜損傷的研究進(jìn)展

王亞飛，洪名云，唐志霞，李婉晴

作者單位：安徽省婦幼保健院、安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽 合肥 230001

目前對(duì)于重度內(nèi)膜損傷依然缺乏行之有效的治療方法，深入了解子宮內(nèi)膜的解剖結(jié)構(gòu)及內(nèi)膜正常的生理性修復(fù)機(jī)制是探索更為有效的治療方法的基礎(chǔ)。干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，在修復(fù)損傷內(nèi)膜時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1 子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及生理性變化

子宮內(nèi)膜由內(nèi)膜表面2/3的功能層和底部1/3的基底層組成。功能層包括致密層和海綿層，隨性激素變化而發(fā)生周期性脫落。腺體的基底部、致密基質(zhì)細(xì)胞和血管構(gòu)成基底層，不發(fā)生周期性的變化。月經(jīng)前期雌、孕激素水平降低，引起內(nèi)膜螺旋血管的收縮以及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致功能層缺血、壞死、脫落。與此同時(shí)子宮內(nèi)膜上皮開(kāi)始非雌激素依賴(lài)性修復(fù)，當(dāng)上皮層修復(fù)完成，功能層間質(zhì)細(xì)胞及血管在雌激素作用下開(kāi)始迅速增殖及生長(zhǎng)［1］。

2 子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)障礙

子宮內(nèi)膜損傷的主要原因有子宮手術(shù)、感染、缺血等，當(dāng)損傷未及基底層時(shí)，依靠自身修復(fù)或者輔以藥物和其他治療手段可完成修復(fù)，當(dāng)基底層受到損傷后，內(nèi)膜的再生能力受到限制，當(dāng)修復(fù)障礙時(shí)就會(huì)形成宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）或者薄型子宮內(nèi)膜。

2.1 宮腔粘連宮腔粘連是由于子宮內(nèi)膜損傷導(dǎo)致宮腔部分或全部閉塞。病因可以歸納為刮宮、手術(shù)（包括黏膜下子宮肌瘤剝除術(shù)、子宮縱隔切除術(shù)等）、感染［2］。纖維細(xì)胞增生活躍、神經(jīng)反射等是解釋IUA成因的主要學(xué)說(shuō)，多數(shù)學(xué)者支持IUA可能與子宮內(nèi)膜基底層損傷后，內(nèi)膜上皮與間質(zhì)細(xì)胞再生困難以及活躍成纖維細(xì)胞增生有關(guān)［3］。宮腔鏡檢查是目前診斷IUA最常用且準(zhǔn)確性最高的一種方法，其他輔助檢查有子宮輸卵管造影、經(jīng)陰道超聲檢查、磁共振等。IUA常用的治療方法是宮腔鏡下粘連分解術(shù)后使用雌激素修復(fù)內(nèi)膜，但效果欠佳［4］。

2.2 薄型子宮內(nèi)膜子宮內(nèi)膜厚度＜7 mm時(shí)在臨床上被診斷為薄型子宮內(nèi)膜［5］。其主要病理改變是大部分受損的基底層內(nèi)膜被上皮單層、纖維組織替代，對(duì)激素刺激反應(yīng)降低，以及腺體數(shù)量和血運(yùn)的不足，導(dǎo)致再生障礙［6］，受損內(nèi)膜往往表現(xiàn)為腺體數(shù)量稀疏、血流灌注不良。目前常用的治療方法有內(nèi)膜微刺激［7］、大劑量雌激素刺激［8］、生長(zhǎng)激素宮腔灌注、盆底神經(jīng)肌肉電刺激、粒細(xì)胞集落刺激因子宮腔注射［9］等。這些方法雖然能在一定程度上能夠改善子宮內(nèi)膜容受性，但對(duì)于嚴(yán)重內(nèi)膜損傷并無(wú)明顯效果。因此深入研究干細(xì)胞在內(nèi)膜損傷治療中的應(yīng)用有著極為重要的臨床意義。

3 干細(xì)胞種類(lèi)

干細(xì)胞分為從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中或原始性腺中分離出來(lái)的胚胎干細(xì)胞及來(lái)源于成熟組織的多能成體干細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化潛能。成體干細(xì)胞現(xiàn)已在多種組織器官中被發(fā)現(xiàn)［10］。雖然胚胎干細(xì)胞在分化潛能方面具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)，但是由于獲取困難和倫理限制實(shí)際應(yīng)用難度較大。目前的主要研究方向是成體干細(xì)胞的應(yīng)用，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC），其治療主要機(jī)制有：（1）多向分化潛能：可定向分化為受損組織細(xì)胞，促進(jìn)組織修復(fù)；（2）旁分泌及外分泌：通過(guò)分泌多種趨化因子、細(xì)胞因子及釋放細(xì)胞外囊泡等，進(jìn)而改善細(xì)胞微環(huán)境、重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)，達(dá)到促進(jìn)組織修復(fù)的作用，近年來(lái)此機(jī)制成為干細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)方向［11］。已有研究證實(shí)，干細(xì)胞分泌的外泌體在缺血-再灌注損傷過(guò)程中，可招募血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新生血管形成，改善血供，促進(jìn)組織損傷修復(fù)［12］；（3）抗炎及免疫調(diào)節(jié)、促血管形成等。下面將分別介紹幾種干細(xì)胞的研究進(jìn)展。

3.1 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞（endometrial stem cells，EDSCs）子宮內(nèi)膜周期性剝脫后的迅速修復(fù)，提示子宮內(nèi)膜中可能存在擁有極強(qiáng)的再生能力的干細(xì)胞。EDSCs這一概念最早由Prianishnikov于1978年提出［3］，但直到2004年，Gargett領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)研究小組才證實(shí)人類(lèi)子宮內(nèi)膜含有少量負(fù)責(zé)子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)的周期性再生的上皮干細(xì)胞和基質(zhì)干細(xì)胞，并且這些細(xì)胞表現(xiàn)出克隆性［13］。目前EDSCs治療子宮內(nèi)膜損傷的機(jī)制尚不明確，Santamaria等［14］根據(jù)相關(guān)研究，推測(cè)子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的功能缺陷可能是子宮內(nèi)膜再生障礙的原因。近年來(lái)，有研究者從正常女性和患有宮腔粘連女性月經(jīng)血中提取子宮內(nèi)膜干細(xì)胞（menstrual blood-derived stem cells，MenSCs）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，正常女性月經(jīng)血中的MenSCs可以在體外分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞，且進(jìn)一步在激素誘導(dǎo)下，在非肥胖非糖尿病非嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠體內(nèi)可再生為子宮內(nèi)膜，但患有宮腔粘連的女性月經(jīng)血中的MenSCs體外分化能力低于實(shí)驗(yàn)組［15］。EDSCs的修復(fù)潛能目前在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均被證實(shí)具有一定有效性及安全性，對(duì)治療子宮內(nèi)膜損傷具有損傷小、無(wú)免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，但獲取方法不易，對(duì)于閉經(jīng)女性及子宮內(nèi)膜損傷患者，由于月經(jīng)量較少甚至沒(méi)有月經(jīng)，不能分離出EDSCs，因此在臨床應(yīng)用中具有一定局限性。

3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymalstem cell，BMSC）BMSC存在于骨髓微環(huán)境中，因其可從骨髓中分離，較易在體外進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴(kuò)增，所以目前應(yīng)用較為廣泛。對(duì)于BMSC治療子宮內(nèi)膜損傷的機(jī)制尚未統(tǒng)一，Zheng等［16］通過(guò)宮腔直接注入和靜脈注射的方式利用BMSCs治療子宮內(nèi)膜損傷，結(jié)果顯示兩種治療方式都能增加內(nèi)膜腺體的數(shù)量，減少內(nèi)膜纖維增生面積。并且治療之后內(nèi)膜雌孕激素受體較治療前都有所增加，因此得出BMSC移植能有效治療子宮內(nèi)膜的損傷，而其主要機(jī)制可能是增加雌孕激素的受體。另有研究用體外分離培養(yǎng)的BMSCs治療子宮內(nèi)膜損傷的大鼠，結(jié)果顯示，促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1等水平下調(diào)，IL-6等抗炎細(xì)胞因子水平上調(diào)，子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，因此認(rèn)為BMSCs能夠通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的再生修復(fù)，以及改善子宮內(nèi)膜容受性，從而達(dá)到治療受損的子宮內(nèi)膜的作用［17］。除上述發(fā)現(xiàn)之外，還有學(xué)者曾進(jìn)行試驗(yàn)評(píng)估血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染的BMSCs（VEGF-transfected BMSCs，VEGF-BMSCs）與 單 純BMSCs移植相比是否有更好的治療效果，結(jié)果表明，VEGF-BMSC移植對(duì)于促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生及改善子宮內(nèi)膜容受性具有更好的治療效果［18］。而最近Ong等［19］指出并沒(méi)有證據(jù)表明BMSCs能轉(zhuǎn)化為子宮內(nèi)膜上皮、基質(zhì)細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞，干細(xì)胞可能系通過(guò)分泌的細(xì)胞因子起治療作用，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了人們普遍認(rèn)為BMSCs能直接促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生的理論，因此，未來(lái)需要更多研究來(lái)明確這個(gè)問(wèn)題。然而，不管BMSCs到底通過(guò)哪種機(jī)制治療子宮內(nèi)膜損傷，上述研究均表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在修復(fù)子宮內(nèi)膜及改善患者臨床癥狀方面均具有明確的治療效果，有很大的臨床的應(yīng)用前景。與此同時(shí)，BMSCs的臨床應(yīng)用也有其限制，如移植后干細(xì)胞低存活率、隨著年齡的增長(zhǎng)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量明顯減少等問(wèn)題，均阻礙了其推廣應(yīng)用。

3.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSCs）hUCMSCs較其他類(lèi)型的干細(xì)胞具有更快的自我更新特性，且來(lái)源豐富容易獲取。更為重要的是hUCMSCs不引起同種或異種免疫細(xì)胞反應(yīng)，定量RT-PCR表明，hUCMSCs產(chǎn)生的人白細(xì)胞抗原（HLA-I）的免疫抑制同種型和不表達(dá)HLA-DR。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，hUCMSCs不表達(dá)免疫反應(yīng)有關(guān)的表面抗原［20］。有研究表明，將hUCMSCs通過(guò)尾靜脈注入內(nèi)膜損傷的小鼠后，可通過(guò)降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和纖維化標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)來(lái)減輕纖維化。細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的子宮內(nèi)膜中呈陽(yáng)性表達(dá)。子宮內(nèi)膜間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白和上皮標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白-19的表達(dá)明顯增加。血管標(biāo)記物CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)普遍上調(diào)。前炎癥因子干擾素γ（proinflammatory factors interferon，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細(xì)胞介素2（interleukin，IL-2）在干細(xì)胞移植后的大鼠中顯著下調(diào)［21］。2018年，Cao等［22］開(kāi)展了用hUCMSCs復(fù)合膠原支架治療復(fù)發(fā)性子宮粘連的I期臨床試驗(yàn)。在粘連分離后將裝載在膠原支架上的臍帶來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞移植到子宮腔中。術(shù)后3個(gè)月，與治療前相比，病人子宮內(nèi)膜平均最大厚度增加，子宮內(nèi)粘連評(píng)分下降。hUCMSCs治療可以改善子宮內(nèi)膜增殖、分化和新生血管形成在組織學(xué)研究中也得到證實(shí)。

3.4 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cell，hAMSC）羊膜是胎盤(pán)的胎兒面，由單層上皮層、基膜層、間質(zhì)層構(gòu)成，具有無(wú)血管無(wú)神經(jīng)等特點(diǎn)。hAMSC具有來(lái)源豐富、取材方便、不涉及倫理問(wèn)題、低免疫原性、無(wú)致瘤性等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)羊膜能釋放有效的免疫調(diào)節(jié)和抗炎細(xì)胞因子（IL-10和IL-6）與傷口愈合相關(guān)的生長(zhǎng)因子，其基質(zhì)中的透明質(zhì)酸可以抑制TGF-β，TGF-β是一種強(qiáng)有力的促纖維化細(xì)胞因子，其減少可抑制膠原合成［23］。這一機(jī)制也揭示了hAMSC移植能有效減少纖維化程度的原因。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與損傷后不治療組相對(duì)比，hAMSCs移植顯著降低促炎細(xì)胞因子（TNF-α及IL-1）的m-RNA水平，并增加抗炎細(xì)胞因子（堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素-6）的表達(dá)［24］，且大鼠子宮內(nèi)膜較厚，腺體數(shù)量增加，纖維化區(qū)域較少。另有研究報(bào)道，給予大鼠尾靜脈移植hAMSCs，2周后熒光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中散在分布PKH26標(biāo)記的hAMSCs，子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目增加、纖維化程度降低，說(shuō)明hAMSCs對(duì)子宮內(nèi)膜的修復(fù)和再生起到了積極作用，可能是通過(guò)分泌作用產(chǎn)生VEGF細(xì)胞因子，誘導(dǎo)血管再生，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)，但此研究中遷移至子宮受損部位的hAMSCs數(shù)量較少，說(shuō)明干細(xì)胞移植的途徑、濃度及時(shí)間均會(huì)影響其遷移至子宮內(nèi)膜，有待進(jìn)一步研究探究［25］。目前有關(guān)hAMSCs對(duì)子宮內(nèi)膜損傷的治療作用的報(bào)道仍較少，若未來(lái)的研究中hAMSCs能被證實(shí)可以更有效地修復(fù)子宮內(nèi)膜，這必將為子宮內(nèi)膜損傷的治療開(kāi)辟新視野。

4 干細(xì)胞的移植方式

對(duì)于干細(xì)胞植入方式的研究甚少，目前移植方式有宮腔注入、靜脈注射、復(fù)合支架植入等。

4.1 干細(xì)胞宮腔注入一種方法是在一定條件下將干細(xì)胞直接注入宮腔，操作簡(jiǎn)便，風(fēng)險(xiǎn)較低；另外一種是將干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成為子宮內(nèi)膜細(xì)胞然后再植入宮腔，這種方法不僅能使整個(gè)過(guò)程相對(duì)可控，而且相對(duì)提高了種植的成功率［15］。

4.2 干細(xì)胞靜脈注射將干細(xì)胞按照一定濃度直接注入靜脈，研究顯示注入大鼠體內(nèi)的干細(xì)胞主要分布在受損的子宮內(nèi)膜中，由此可以證明靜脈注射是一種有效的移植方法［26］。為保證最大的治療效果，往往需要大量的細(xì)胞數(shù)量。但數(shù)量較多的干細(xì)胞進(jìn)入靜脈有引起靜脈栓塞的可能［27］。

4.3 干細(xì)胞復(fù)合支架植入支架又分為生物支架和合成高分子支架。有研究報(bào)道，hUCMSCs復(fù)合膠原支架用于創(chuàng)面修復(fù)治療的有效性，但這種支架存在引起超敏反應(yīng)、免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［28］。合成高分子支架因其結(jié)構(gòu)可控、功能多樣、可規(guī)?；a(chǎn)而在組織工程中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，有研究顯示聚癸二酸甘油酯（PGS）支架搭載移植BMSCs組的妊娠率顯著高于膠原支架搭載移植組和聚乳酸乙醇酸（PLGA）支架搭載移植組。因此PGS支架復(fù)合干細(xì)胞可能是一種有更前景的治療損傷內(nèi)膜的方式［29］。

5 干細(xì)胞治療存在的風(fēng)險(xiǎn)

盡管干細(xì)胞的應(yīng)用突破了傳統(tǒng)治療的諸多限制，但在治療的安全性和有效性方面仍面臨諸多問(wèn)題。一方面，干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有相似的調(diào)控生長(zhǎng)和凋亡機(jī)制，都能不斷增殖，因此干細(xì)胞具有形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，干細(xì)胞常表現(xiàn)出基因組的不穩(wěn)定性。雖然提高干細(xì)胞分離的純度、將干細(xì)胞在體外向目標(biāo)終末細(xì)胞分化并采用合適的移植方式能在一定程度上降低上述風(fēng)險(xiǎn)，但要實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞治療風(fēng)險(xiǎn)可控、結(jié)局可預(yù)期仍需要不斷探索。

6 展望

基底層受損的子宮內(nèi)膜的修復(fù)仍是一個(gè)難題，干細(xì)移植突破了傳統(tǒng)治療的局限性，從細(xì)胞水平再生修復(fù)損傷的內(nèi)膜，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。但當(dāng)前關(guān)于干細(xì)胞應(yīng)用的研究仍局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。干細(xì)胞來(lái)源的選擇、劑量的控制和移植的方式的選擇以及干細(xì)胞應(yīng)用的安全性和有效性仍需要不斷探索。