生物鐘基因在卵巢癌中的研究進(jìn)展

俞元瑛，崔李寧

卵巢癌發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中位居第三，根據(jù)最新流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新發(fā)卵巢癌313 959例，其中死亡207 252例[1]，死亡率位居?jì)D科惡性腫瘤之首。因缺乏有效、特定的篩查方法和能夠早期診斷的方法，絕大多數(shù)卵巢癌患者在確診時(shí)已為晚期，存在局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率約為46%[2]。在治療過(guò)程中，卵巢癌患者死亡的最主要原因?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)和瘤體轉(zhuǎn)移[3]。目前，對(duì)于卵巢癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不完全清楚，因此，探尋卵巢癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)其篩查、早期診斷及后續(xù)治療意義重大。哺乳動(dòng)物的活動(dòng)具有晝夜節(jié)律，晝夜節(jié)律由生物鐘控制，對(duì)生物鐘而言，生物鐘基因是其分子基礎(chǔ)[4]。女性卵巢的生殖周期受晝夜節(jié)律的影響，本文就近些年生物鐘、生物鐘基因與卵巢癌的研究進(jìn)展予以綜述，并對(duì)今后的研究作出展望。

1 晝夜節(jié)律與生物鐘及生物鐘基因

在哺乳動(dòng)物中，晝夜節(jié)律是機(jī)體內(nèi)的一種生理現(xiàn)象，大約24 h為周期，使機(jī)體的生理過(guò)程與外界環(huán)境的變化相協(xié)調(diào)，是適應(yīng)環(huán)境的一種表現(xiàn)，涉及機(jī)體多系統(tǒng)功能調(diào)控。

晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和維持依賴于中樞及外周兩個(gè)生物鐘系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物的中樞生物鐘位于視交叉上核（SCN）[5]，白天光信號(hào)通過(guò)視網(wǎng)膜下丘腦束傳入，夜間松果體分泌出褪黑素進(jìn)行反饋，以此調(diào)控晝夜節(jié)律[6]。外周生物鐘則存在于全身大多數(shù)外周組織中，不僅可以被中樞生物鐘調(diào)控，接受SCN的神經(jīng)、體液或其他信號(hào)因子調(diào)控，也可自主運(yùn)行，自行調(diào)控基因表達(dá)，這些基因表達(dá)與各組織特異性的功能相關(guān)[7]。兩者共同作用，協(xié)調(diào)哺乳動(dòng)物的生理活動(dòng)，使之隨晝夜交替，從而呈現(xiàn)節(jié)律性變化。

生物鐘基因?yàn)樯镧姰a(chǎn)生、維持晝夜節(jié)律的分子基礎(chǔ)[4,8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，有十多個(gè)生物鐘基因形成生物鐘調(diào)控系統(tǒng)的負(fù)反饋轉(zhuǎn)錄翻譯環(huán)路，包括Bmal1、Clock、Per、Cry、Ror、Rev-Erb、Tef、Dbp及Hlf等。Bmal1基因編碼的蛋白質(zhì)與Clock基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合，可形成Bmal1/Clock異二聚體。白天時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Bmal1/Clock異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到生物鐘基因Per和Cry上游啟動(dòng)子的E-box元件，激活其轉(zhuǎn)錄。激活后，Per、Cry不斷地被轉(zhuǎn)錄和翻譯，于是在細(xì)胞質(zhì)中，Per蛋白、Cry蛋白不斷地生成、積累，同時(shí)與AMP活化蛋白激酶（AMPK）和酪蛋白激酶I（CKI和CKI）相互作用。夜晚時(shí)，Per與Cry復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核內(nèi)與Dbox元件相結(jié)合，而D-box元件則位于Bmal1和Clock的啟動(dòng)子區(qū)域。該結(jié)合物不僅抑制Bmal1、Clock轉(zhuǎn)錄，還有負(fù)性調(diào)節(jié)功能。而后，Per蛋白、Cry蛋白在CKI、CKI的催化下，發(fā)生磷酸化和泛素化修飾反應(yīng)而被進(jìn)一步降解，隨著Per蛋白和Cry蛋白降解，其抑制作用也隨之消失。抑制作用消失后，Bmal1/Clock異二聚體便可再次表達(dá)，開(kāi)始新的轉(zhuǎn)錄循環(huán)[9-10]。與此同時(shí)，核受體基因Ror/、Rev-Erb/啟動(dòng)子上的E-box元件，可與Bmal1/Clock異二聚體結(jié)合，隨后促進(jìn)Ror/、Rev-Erb/轉(zhuǎn)錄，生物鐘基因轉(zhuǎn)錄翻譯震蕩機(jī)制的輔助環(huán)路由此啟動(dòng)。而Ror/、Rev-Erb/轉(zhuǎn)錄翻譯的Ror/蛋白、Rev-Erb/蛋白，與Bmal1啟動(dòng)子區(qū)的受體應(yīng)答元件可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。在Bmal1的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，Ror/蛋白起促進(jìn)作用，而Rev-Erb/蛋白起抑制作用。因此，Ror/和Rev-Erb/轉(zhuǎn)錄翻譯的Ror/蛋白和Rev-Erb/蛋白，對(duì)生物鐘主環(huán)路存在另一種調(diào)控作用[11]。

除了Bmal1、Clock、Per、Cry、Rev-Erb、Ror等這些目前研究較多的核心生物鐘基因之外，還有一些鐘控基因組成了另外的轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路，比如E4bp4、Dbp、Hlf等轉(zhuǎn)錄因子家族。E4bp4基因是Rev-Erbs的靶基因，Dbp基因是Bmal1/Clock異二聚體的靶基因，兩者可在細(xì)胞核內(nèi)與Dbox元件結(jié)合，對(duì)Per基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[12]。Hlf基因有明顯的節(jié)律性，可作為生物鐘的輸出調(diào)節(jié)劑，有抑制細(xì)胞死亡的作用[13]。

2 生物鐘與卵巢

卵巢是女性產(chǎn)生、排出卵子并分泌甾體激素的性器官。目前研究表明，卵巢細(xì)胞中的生物鐘在卵巢生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。卵巢的生殖周期受晝夜節(jié)律的影響，其節(jié)律性接受神經(jīng)和內(nèi)分泌組織的協(xié)調(diào)及同步活動(dòng)。這種協(xié)調(diào)是由下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸各層面的基因表達(dá)和細(xì)胞生理學(xué)促進(jìn)的。有研究報(bào)道在HPO軸的各組織中均已觀察到生物鐘基因的表達(dá)[14]，各層次的生物鐘相互協(xié)調(diào)和同步，維持正常的生殖行為。晝夜節(jié)律的產(chǎn)生、維持和調(diào)控依賴連鎖的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路（TTFL），其決定著HPO軸每個(gè)組織中基因表達(dá)的周期和振幅。卵巢的生物鐘接受SCN的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控，同時(shí)又具有自主性。

SCN能產(chǎn)生精氨酸加壓素（AVP）和血管活性腸肽（VIP）。AVP信號(hào)對(duì)于GnRH神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的視交叉上核調(diào)節(jié)同樣至關(guān)重要。AVP受Bmal1/Clock復(fù)合物的調(diào)節(jié),并以雌激素依賴的方式刺激Kisspeptin神經(jīng)元[15]，Kisspeptin神經(jīng)元接受刺激后分泌Kisspeptin多肽。Kisspeptin多肽在生殖中的主要作用是刺激促性腺激素釋放激素（GnRH）神經(jīng)元，該神經(jīng)元?jiǎng)t將GnRH釋放到垂體-門(mén)脈系統(tǒng)中，GnRH促進(jìn)垂體釋放促卵泡激素和黃體生成素，兩者進(jìn)入血液，作用于卵巢，以促進(jìn)接下來(lái)的生理活動(dòng)[16]。VIP則可刺激GnRH神經(jīng)元活動(dòng)。HPO軸上各種生物鐘相互協(xié)調(diào)和同步以促進(jìn)正常生殖行為。

3 生物鐘基因與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展

相關(guān)研究顯示，許多健康問(wèn)題的發(fā)生率與生物鐘的改變和破壞直接相關(guān)[17]，也有研究認(rèn)為生物鐘受到破壞引起的疾病，是由生物鐘基因劑量變化和連鎖的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路中的基因劑量失去控制所致[18]。

卵巢腫瘤可發(fā)生于任何年齡，為常見(jiàn)的婦科腫瘤。其中惡性卵巢腫瘤早期病變不易被發(fā)現(xiàn)，晚期時(shí)缺乏有效的治療手段，為婦科惡性腫瘤中致死率最高的疾病。卵巢的生物鐘被打亂，或與其他部位生物鐘的晝夜節(jié)律不同步，會(huì)導(dǎo)致各種生殖疾病的發(fā)生和發(fā)展，其中包括卵巢癌。

3.1 Bmal1基因與卵巢癌 Bmal1基因，也稱作Arntl基因，在分子水平，是哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律震蕩器中的關(guān)鍵元件之一。它編碼蛋白質(zhì)Bmal1，位于11號(hào)染色體短臂，通過(guò)自身的表達(dá)調(diào)控、正負(fù)反饋通路和其他機(jī)制產(chǎn)生晝夜節(jié)律性。Bmal1基因不僅表達(dá)于所有視交叉上核細(xì)胞，在多數(shù)外周細(xì)胞中也存在表達(dá)[19]。

Bmal1基因編碼的Bmal1蛋白通過(guò)與Clock基因編碼的Clock蛋白結(jié)合后，形成Bmal1/Clock異二聚體，與Per、Cry等基因形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋循環(huán)，在此反饋循環(huán)中Bmal1基因起到核心調(diào)控作用。在分子水平上，Bmal1基因參與腫瘤的發(fā)生，不僅表現(xiàn)在其發(fā)生異常之后導(dǎo)致正常細(xì)胞的細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡異常，為細(xì)胞的惡變創(chuàng)造條件；還表現(xiàn)在該基因影響細(xì)胞侵襲性、腫瘤分期，與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。

在消化道、頭頸、血液系統(tǒng)等腫瘤中，Bmal1基因是抑癌基因。有研究發(fā)現(xiàn)，沉默Bmal1基因會(huì)令癌細(xì)胞加速增殖。因?yàn)橐种艬mal1基因表達(dá)后，抑癌基因p53的表達(dá)隨之受到抑制。p53基因表達(dá)受抑制，使細(xì)胞周期蛋白B1、D1和E合成受到促進(jìn)，從而導(dǎo)致DNA損傷降低，細(xì)胞的凋亡減少，腫瘤細(xì)胞的增殖因此受促。實(shí)驗(yàn)表明，Bmal1過(guò)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖[20-21]。Jung等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因可通過(guò)拮抗致癌基因Bclw、抑制PI3K-Akt-MMP-2信號(hào)通路，降低腦膠質(zhì)瘤的侵襲性。同時(shí)Rana等[23]發(fā)現(xiàn)，Bmal1缺失后，轉(zhuǎn)錄下游與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的靶基因可缺失，慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制或與此相關(guān)。

在卵巢癌中，Bmal1基因起到抑制作用。Bmal1基因表達(dá)受抑后，p53的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞周期蛋白D1合成增加，DNA損傷降低，細(xì)胞凋亡減少，腫瘤細(xì)胞便增殖。細(xì)胞周期蛋白D1是一種與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4選擇性相關(guān)的調(diào)節(jié)激酶亞單位，是細(xì)胞周期G1進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[24]。有研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者中，細(xì)胞周期蛋白D1過(guò)表達(dá)，卵巢腫瘤中細(xì)胞周期蛋白D1的擴(kuò)增很少發(fā)生[25]。因此，Bmal1基因過(guò)表達(dá)，對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖起到抑制作用。

3.2 Clock基因與卵巢癌 Clock基因在分子水平，也是哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律震蕩器中的關(guān)鍵元件之一。它編碼蛋白質(zhì)Clock，位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂，通過(guò)自身的表達(dá)調(diào)控、正負(fù)反饋通路和其他機(jī)制產(chǎn)生晝夜節(jié)律性。Clock基因在下丘腦視交叉上核表達(dá)。

Clock基因編碼的Clock蛋白通過(guò)與Bmal1基因編碼的Bmal1蛋白結(jié)合形成Bmal1/Clock異二聚體，與Per、Cry等基因形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋循環(huán)，在此反饋循環(huán)中Clock基因同Bmal1基因一樣，有核心調(diào)控作用。此外，Matsuo等[26]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Clock能激活WEEL的啟動(dòng)子，使細(xì)胞分裂周期基因2磷酸化，導(dǎo)致其失活，抑制細(xì)胞G2/M期過(guò)渡，以此調(diào)控細(xì)胞周期。

Xu等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)順鉑敏感A2780和順鉑耐藥CP70細(xì)胞中Clock mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與順鉑敏感的A2780細(xì)胞比較，后者Clock mRNA和蛋白表達(dá)均增加。而在敲除后者的Clock基因后，順鉑能夠使細(xì)胞增殖受抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該實(shí)驗(yàn)表明，Clock基因在癌細(xì)胞中的表達(dá)與順鉑耐藥性有關(guān)。卵巢癌細(xì)胞中Clock基因的上調(diào)，可導(dǎo)致其對(duì)順鉑治療的敏感性降低。

3.3 Per基因與卵巢癌 Per基因同為重要組成部分，有Per1、Per2、Per3等亞型，分別編碼蛋白質(zhì)Per1、Per2、Per3等，位于17號(hào)染色體短臂。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，晝夜節(jié)律紊亂的卵巢癌患者腫瘤樣本中，生物鐘基因Per轉(zhuǎn)錄的Per1、Per2蛋白表達(dá)顯著降低[28]。Per1、Per2蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Bmal1/Clock異二聚體生成起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也抑制Bmal1基因和Clock基因轉(zhuǎn)錄[10]。

同時(shí)，Per1在不同的癌組織中存在差異表達(dá)，在各種卵巢癌中，Per1的表達(dá)均低于正常卵巢組織。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，Per1基因低表達(dá)的卵巢癌患者，總體生存率低下。在I期和II期卵巢癌患者中，Per1表達(dá)降低與預(yù)后不良相關(guān)，而在III期和IV期患者中，Per1表達(dá)升高和p53突變與總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存率差相關(guān)。在卵巢癌患者中，Per1表達(dá)水平與包括中性粒細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，并與多種免疫標(biāo)記物密切相關(guān)。Per1表達(dá)降低與總體生存率低顯著相關(guān)[29]。

有研究發(fā)現(xiàn)，Per2表達(dá)與卵巢上皮性腫瘤關(guān)系密切，隨著腫瘤惡性期別升高，Per2基因表達(dá)逐漸減少或缺失。腫瘤組織的缺氧條件，可通過(guò)降解Per2引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因激活，使腫瘤出現(xiàn)高侵襲力。Per2可能是通過(guò)下調(diào)bcl-2基因，該基因是一種腫瘤凋亡抑制基因，從而促進(jìn)凋亡基因bax表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制卵巢癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑瘤作用[30]。他們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Per2在局部持續(xù)高表達(dá)，可降低卵巢癌腫瘤組織中VEGF/VP表達(dá)，降低微血管的密度，說(shuō)明其可能通過(guò)抑制血管新生來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Per2還可導(dǎo)致MMP-9和MTA-1表達(dá)顯著降低，MMP-9和MTA-1與腫瘤侵襲性高度相關(guān)，進(jìn)而抑制腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。在卵巢癌的移植瘤中，Per2基因過(guò)表達(dá)可降低PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)，該信號(hào)通路的激活刺激腫瘤血管形成，細(xì)胞惡性增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。由此推測(cè)，Per2基因通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，凋亡異常細(xì)胞，進(jìn)而抑制卵巢癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑瘤作用[31]。

4 生物鐘基因與卵巢癌的診療

研究Bmal1、Clock、Per等生物鐘基因表達(dá)與卵巢癌病理學(xué)指標(biāo)等臨床特征相關(guān)性，能夠豐富腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為臨床的卵巢癌預(yù)防、診斷提供新的思路。腫瘤時(shí)辰治療是以人體正常的晝夜節(jié)律、不同時(shí)間腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)特性的差異為依據(jù)，將治療方案?jìng)€(gè)體化，從而降低藥物毒性，提高治療效果的一種治療方式。腫瘤時(shí)辰化療不僅已有所應(yīng)用，且療效甚佳。Levi等[32]發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間對(duì)患者予抗腫瘤藥物治療，與錯(cuò)誤時(shí)間給藥或持續(xù)給藥相比，根據(jù)時(shí)辰治療的要求給藥時(shí)，藥物毒性反應(yīng)可減少5倍。

相信隨著對(duì)Bmal1、Clock、Per等生物鐘基因的研究逐漸深入，根據(jù)晝夜節(jié)律制定卵巢癌患者的個(gè)體化治療方案指日可待，對(duì)生物鐘基因的研究將極大地提高腫瘤治療效果，降低藥物的不良反應(yīng)。

5 展望與未來(lái)

不同的生物鐘基因在卵巢癌中的作用各不相同，盡早明確各個(gè)生物鐘基因的作用機(jī)制與卵巢癌的關(guān)系，不僅能幫助臨床醫(yī)生及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌患者，還能指導(dǎo)臨床優(yōu)化卵巢惡性腫瘤患者的個(gè)體化治療方案。