細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)的研究進(jìn)展

朱 茵，朱靜怡，趙起超，2，謝 恬，2，陳功星，2

（1.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)部，浙江 杭州 311121；2.浙產(chǎn)中藥材資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311121）

細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)（cellular thermal shift assay，CETSA）是一種可直接檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)藥物與靶標(biāo)蛋白結(jié)合程度的研究方法，自2013 年研發(fā)以來(lái)，被廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)蛋白的分析，其中大多數(shù)是細(xì)胞內(nèi)的可溶性靶標(biāo)蛋白；CETSA 最早通過(guò)PCR 和蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）技術(shù)顯示靶標(biāo)結(jié)合情況，隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，CETSA 可在高密度微孔板中用均相法測(cè)定、顯示靶標(biāo)結(jié)合情況，這一發(fā)展實(shí)現(xiàn)了CETSA 向高通量模式的轉(zhuǎn)變[1]。目前，CETSA 與雙向凝膠電泳（2-DE）、質(zhì)譜分析法（MS）和熒光檢測(cè)法等技術(shù)的結(jié)合，推動(dòng)了CETSA 走向一個(gè)新高峰，這有可能為蛋白質(zhì)及其相關(guān)學(xué)科研究提供新的方向。本文將對(duì)該技術(shù)的原理、應(yīng)用以及相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為推進(jìn)CETSA 技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，生物大分子結(jié)合研究提供參考。

1 CETSA 技術(shù)的原理

蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象決定了特定理化性質(zhì)，細(xì)胞組織中的蛋白質(zhì)可與相應(yīng)分子結(jié)合。CETSA 的原理如下：蛋白質(zhì)溶液在聚集溫度（aggregation temperature，Tagg）或熔解溫度（melting temperature，Tm）加熱，會(huì)以類似于蛋白質(zhì)純化的方式先進(jìn)行展開(kāi)而后聚集，而當(dāng)小分子物質(zhì)與靶蛋白結(jié)合后，會(huì)使靶蛋白的熱穩(wěn)定性增加，這種改變了Tagg 或Tm 從而改變熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的聚集，被稱為細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移[1]。該技術(shù)的主要步驟是先用實(shí)驗(yàn)組（藥物）和對(duì)照組（空載）分別處理活細(xì)胞或細(xì)胞裂解液，并在數(shù)分鐘內(nèi)用熱（37 ℃～70 ℃）分別處理兩組，然后離心去除因熱變性而沉淀的蛋白，取上清可溶蛋白樣本，采用WB、2-DE、MS 等實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定并對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的可溶性蛋白點(diǎn)，尋找出其中因熱穩(wěn)定性發(fā)生變化而在兩組中顯示有所差異的蛋白，并按常規(guī)方法測(cè)定其氨基酸序列，再根據(jù)序列檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最后根據(jù)分析結(jié)果驗(yàn)證該蛋白的功能[2]。

2 CETSA 技術(shù)的應(yīng)用

2.1 新藥研發(fā) 在CETSA 被發(fā)明之前，藥物開(kāi)發(fā)面臨多重挑戰(zhàn)，臨床上大多數(shù)作用于細(xì)胞或組織的藥物是通過(guò)直接與一個(gè)或幾個(gè)靶蛋白結(jié)合而達(dá)到治療效果的，而藥物與靶蛋白的結(jié)合不能在細(xì)胞和組織中直接測(cè)量，研究者常需根據(jù)藥物在臨床試驗(yàn)中的成敗才能證明該藥物能否與細(xì)胞或組織中的預(yù)期藥物靶點(diǎn)結(jié)合，這導(dǎo)致藥物研發(fā)成本高、周期長(zhǎng)、危險(xiǎn)性大。CETSA 作為一種非標(biāo)記方法，可用于直接確認(rèn)藥物是否與預(yù)期靶點(diǎn)結(jié)合，從而保障新藥的研發(fā)。此外CETSA 能在研究藥物作用的相關(guān)通路與機(jī)制的同時(shí)，確定藥物作用靶標(biāo)的先后次序[3]。CETSA 的這些優(yōu)勢(shì)不僅克服了以往藥物研發(fā)中的難關(guān)，還促進(jìn)了藥物大規(guī)模的開(kāi)發(fā)。目前，CETSA 已運(yùn)用于抗微生物藥物、抗腫瘤等藥物的研發(fā)中，并取得一定成效，它很可能成為臨床前研究和臨床藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)有效工具。

登革熱病毒和寨卡病毒為主要的黃病毒，該種病毒造成了世界性的健康和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。Rothan HA等[4]發(fā)現(xiàn)Hrd1 泛素連接酶介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解通路可調(diào)控黃病毒在宿主內(nèi)的復(fù)制，而化合物CDDO-Me 作為Hrd1 泛素連接酶的抑制劑，對(duì)登革熱病毒和寨卡病毒具有廣譜活性。應(yīng)用CETSA 發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me 與Hrd1 通路中的關(guān)鍵蛋白grp94 結(jié)合而發(fā)揮作用，如果對(duì)grp94 蛋白抑制劑進(jìn)行深入的研究，就很可能會(huì)產(chǎn)生一類新的廣譜抗黃病毒藥物。與此相似，甲型流感病毒感染是一種威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生疾病，隨著現(xiàn)有抗流感藥物耐藥性的不斷增強(qiáng)，迫切需要新的抗病毒藥物，特別是天然藥物。Lai YN 等[5]利用CETSA 證明天然藥物異歐前胡素對(duì)神經(jīng)氨酸酶（NA）介導(dǎo)的子代病毒釋放過(guò)程有抑制作用，異歐前胡素可能將成為預(yù)防和治療甲型流感病毒的潛在藥物。

CETSA 在抗腫瘤藥物的研發(fā)中應(yīng)用更為廣泛。Akt 是多種癌癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，也是肝細(xì)胞癌（HCC）的重要的調(diào)節(jié)因子，而Hongwei L 等[6]發(fā)現(xiàn)了一種名為HTBPI 的生物堿，并利用CETSA 證實(shí)HTBPI 可靶向Akt 并占據(jù)其結(jié)合域，使Akt 功能失活，從而抑制相關(guān)腫瘤分子通路，HTBPI 可能會(huì)成為靶向Akt 的HCC 潛在治療藥物。此外，研究人員[7]通過(guò)CETSA 等方法，證實(shí)化合物Aspulvinone O 是谷草酰胺轉(zhuǎn)移酶的有效抑制劑。它抑制了谷氨酰胺的代謝，使胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制了癌細(xì)胞的增殖，這使得Aspulvinone O 有望成為治療胰腺導(dǎo)管腺癌的新型藥物。TACC3 基因表達(dá)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥中。Akbulut O 等[8]利用CETSA 等技術(shù)證實(shí)一種新的靶向藥物BO-264 與TACC3 相互作用，從而降低TACC3 表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)抗癌作用，這為乳腺癌等化療藥物的研發(fā)提供了新方向。另外，不少研究者利用CETSA 尋找到了已有藥物的作用靶標(biāo)和相關(guān)分子信號(hào)通路，這為藥物的創(chuàng)新打開(kāi)了一扇門。例如藥物Daphnegiravone D（DGD）可誘導(dǎo)HCC 細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，但其具體的靶蛋白仍不清楚。Shang XY 等[9]發(fā)現(xiàn)DGD 可改變?cè)S多蛋白的表達(dá)但以ART 蛋白的改變最為顯著，而CETSA 結(jié)果直接提示了DGD 可以直接靶向ART蛋白；STAT3 蛋白常常在癌癥細(xì)胞中上調(diào)，Lee YJ等[10]發(fā)現(xiàn)一種名為EXT 的蒼耳提取物可降低STA T3-Y705 的磷酸化表達(dá)，并利用CETSA 證明了EXT與STAT3 蛋白的結(jié)合，從而抑制STAT3 的激活，EXT 有望成為癌癥治療的有效藥物。

在其他藥物的研發(fā)中，一種名為M.accedens的植物可被用于外敷退熱，但其抗炎機(jī)制尚不清楚。Kim JY 等[11]利用CETSA 發(fā)現(xiàn)M.acedens 的甲醇提取物Ma-ME 可與NF-κB 信號(hào)通路中最上游的Syk蛋白結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)抗炎。抑制淀粉樣β 肽前體蛋白切割酶-1（BACE1）是治療阿爾茲海默癥的潛在途徑。Chambers M等[12]從ChemBridge DiverSet 化合物庫(kù)中選取了3 種待測(cè)化合物，并利用CETSA 篩選出了一種與BACE1 相結(jié)合的化合物C34，該分子將有望成為治療阿爾茲海默癥的潛在藥物。在肺部囊腫性纖維化治療中，單種藥物治療肺功能有很大的局限性，而Carlile GW 等[13]利用CETSA 證實(shí)伴侶分子MCG1516A 可能是治療囊腫性纖維化的第3 個(gè)重要藥理位點(diǎn)，推進(jìn)了三聯(lián)藥物療法的發(fā)展以及囊性纖維化的治療進(jìn)程。阻斷絲氨酸蛋白酶9（PCSK9）與低密度脂蛋白（LDL）受體進(jìn)行蛋白與蛋白間的相互作用可有效降低LDL 膽固醇水平，而Petrilli WL 等[14]確定了一種與PCSK9 有著高親和力并能誘導(dǎo)其分解的化合物，從而阻斷了這種蛋白質(zhì)之間的相互作用，有效降低了LDL 膽固醇水平。

2.2 藥物評(píng)估和優(yōu)化 臨床上有些藥物治療效果良好，但其相關(guān)機(jī)制尚不能明確，而靶標(biāo)結(jié)合狀態(tài)是評(píng)估藥物有效性和開(kāi)發(fā)潛能的關(guān)鍵依據(jù)。CETSA 自開(kāi)發(fā)以來(lái)，常用于細(xì)胞或組織水平的靶標(biāo)結(jié)合情況的檢測(cè)，Ishii T 等[15]首次報(bào)道了CETSA 應(yīng)用于動(dòng)物和臨床研究，證實(shí)了CETSA 可以定量評(píng)估小鼠脾臟以及大腦內(nèi)藥物的靶標(biāo)參與。Perrin J 等[16]則通過(guò)Blood-CETSA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了組織和全血中藥物的靶標(biāo)結(jié)合情況，進(jìn)一步拓展了該技術(shù)的檢測(cè)范圍，同時(shí)也為藥物的臨床評(píng)估和優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

CETSA 可以檢測(cè)藥物與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的結(jié)合狀況從而有效評(píng)估藥物作用效果，同時(shí)這也為優(yōu)化藥物在細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)結(jié)合提供了新思路[17]?？共《舅幬镌趶?fù)雜的生理環(huán)境中使用時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，Tomas F 等[18]利用MS-CETSA 評(píng)估了FDA 批準(zhǔn)的一組抗病毒化合物在宿主細(xì)胞中的靶點(diǎn)，以此更好的了解藥物脫靶與療效之間的關(guān)系，該方法可以用于快速篩選和利用已存在的抗病毒藥物來(lái)應(yīng)對(duì)新出現(xiàn)的病毒，有望成為研發(fā)抗2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）藥物的有效方法。此外，STAT3 蛋白往往在癌癥細(xì)胞中上調(diào)，除了在利用CETSA 開(kāi)發(fā)STAT3 抑制劑的同時(shí)，還可評(píng)估已知的STAT3 抑制劑在生物環(huán)境中與STAT 蛋白的結(jié)合能力，從而實(shí)現(xiàn)CETSA 對(duì)相關(guān)藥物從研發(fā)到評(píng)估和優(yōu)化的全程利用[19]。Tan BX 等[20]還通過(guò)CETSA 驗(yàn)證一種新型治療藥物——裝訂肽（stapled peptide）與Mdm2 基因和Mdm4 基因的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)仍需要進(jìn)一步提高裝訂肽進(jìn)入細(xì)胞和結(jié)合靶標(biāo)的效率，而CETSA 的存在則為優(yōu)化該藥物提供了有效的工具。CETSA 也為優(yōu)化藥物的耐藥性提供了思路，Langeback A 等[21]利用CETSA 評(píng)估患者在臨床治療中對(duì)紫杉烷類藥物的敏感性和耐藥性，以便對(duì)不同患者的用藥進(jìn)行劑量分層，實(shí)現(xiàn)了紫杉醇類藥物治療的優(yōu)化。

2.3 基因表達(dá) 基因表達(dá)是分子生物學(xué)的重要內(nèi)容，而蛋白質(zhì)的研究開(kāi)展較困難，CETSA 可應(yīng)用于對(duì)基因表達(dá)的研究。Dai L 等[22]利用CETSA 發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)復(fù)合體在細(xì)胞周期特定階段的表達(dá)有所不同，反映出這些蛋白在核膜解體、DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程中的作用意義，這為研究完整細(xì)胞中蛋白質(zhì)的相互作用提供了新方法。

3 CETSA 技術(shù)的新發(fā)展

技術(shù)的特征之一就是不斷的改進(jìn)以滿足科學(xué)發(fā)展的需要。CETSA 的原理是基于靶蛋白在結(jié)合藥物分子后通常變得穩(wěn)定，也可利用其他方法顯現(xiàn)出來(lái)。在CETSA 創(chuàng)立之初，研究者通常用WB 和PCR 檢測(cè)，但隨著CETSA 的不斷發(fā)展，CETSA 逐漸與2-DE、MS、熒光檢測(cè)等技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了CETSA 向高通量的轉(zhuǎn)變，同時(shí)極大拓寬了CETSA 的應(yīng)用范圍，受到更多研究者認(rèn)可及應(yīng)用，并不斷地創(chuàng)新。

3.1 基于雙向凝膠電泳的CETSA 技術(shù) Nagasawa I等[23]將CETSA 和雙向凝膠電泳（2-DE）結(jié)合起來(lái)形成基于雙向凝膠電泳的CETSA 技術(shù)（2DECETSA），用它對(duì)結(jié)合了新化合物后熱穩(wěn)定性發(fā)生變化的蛋白組學(xué)進(jìn)行分析，并成功利用這種方法發(fā)現(xiàn)一種名為NPD10084 的化合物，作用于PKM2 蛋白并阻斷PKM2 與β-catenin 或STAT3 蛋白的作用，從而抑制下游通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)直結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制，2D-CETSA 可進(jìn)行全蛋白組范圍內(nèi)靶標(biāo)蛋白篩選，尤其適用于未知靶標(biāo)的藥物，這為探究未知的靶蛋白和新藥的研發(fā)提供了強(qiáng)大工具。擴(kuò)展到蛋白組范圍內(nèi)的CETSA 使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加精確化和科學(xué)化，減小了傳統(tǒng)CETSA 的限制性，使得細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)有了一個(gè)大的飛躍。

3.2 基于質(zhì)譜分析技術(shù)的細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù) 在過(guò)去10 年中，質(zhì)譜分析技術(shù)（MS）取得了巨大進(jìn)展，現(xiàn)在MS 可以快速對(duì)人類蛋白質(zhì)組中天然和修飾的蛋白質(zhì)或者肽進(jìn)行分子量測(cè)定[24]。基于質(zhì)譜分析技術(shù)的細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)（MS-CETSA）是利用MS 對(duì)CETSA中的可溶性蛋白進(jìn)行分子量的測(cè)定，再通過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)分析該蛋白，MS-CETSA 現(xiàn)已被用于識(shí)別各種藥物的未知靶點(diǎn)[25]，這也為研究者提供了一個(gè)可同時(shí)觀察由化合物介導(dǎo)的數(shù)千種蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變的平臺(tái)[26]?，F(xiàn)如今該技術(shù)較為成熟，應(yīng)用也較廣泛，MS-CETSA 為人們提供了一個(gè)研究蛋白功能變化的詳細(xì)而全面的新平臺(tái)[25]。例如Sun W 等[27]提出MSCETSA 可以直接在蛋白質(zhì)組水平上監(jiān)測(cè)ROS 和蛋白結(jié)構(gòu)的氧化還原變化，了解不同蛋白質(zhì)在細(xì)胞活性氧反應(yīng)中的特定作用，并且還發(fā)現(xiàn)了新的活性氧敏感性候選蛋白。大多數(shù)蛋白質(zhì)與代謝物之間的相互作用弱于蛋白質(zhì)與藥物之間的相互作用，而研究者又缺乏對(duì)傳統(tǒng)CETSA 的特異性和假陽(yáng)性的分析，此為CETSA 的一大缺陷。而Lim YT 等[28]則通過(guò)利用MS-CETSA 來(lái)快速顯示蛋白質(zhì)與代謝物在裂解物或細(xì)胞中的相互作用，彌補(bǔ)了這一缺陷?？傊?，MS-CETSA 相對(duì)于傳統(tǒng)的CETSA 的優(yōu)勢(shì)是可以鑒定藥物直接作用的靶標(biāo)蛋白及其對(duì)下游通路的影響，并且可以檢測(cè)反應(yīng)微弱的蛋白質(zhì)與代謝物之間的作用，是CETSA 的一個(gè)極大優(yōu)勢(shì)。

3.3 基于熒光檢測(cè)法的CETSA 技術(shù) Martinez NJ等[29]介紹了一種基于分裂納米熒光素酶的CETSA技術(shù)（SplitLuc CETSA），該技術(shù)是一種以高通量（384 和1536 孔板）形式的檢測(cè)方法，無(wú)需檢測(cè)試劑與蛋白的結(jié)合，對(duì)于各種靶標(biāo)有廣泛適用性，為不易獲得表型和需要與蛋白結(jié)合才能測(cè)定的方法定提供了一個(gè)快速的檢測(cè)和篩選平臺(tái)。Asawa RR 等[30]運(yùn)用SplitLuc CETSA 檢測(cè)了394 種已知的組蛋白去乙?；?（HDAC1）抑制劑與HDAC1 的結(jié)合效果，并從中發(fā)現(xiàn)了兩種靶向其他HDAC 的抑制劑。此外，Park H 等[31]開(kāi)發(fā)了一種基于熱穩(wěn)定性改變能夠引起凝膠內(nèi)熒光差異原理的檢測(cè)技術(shù)（TS-FITGE），這是一種無(wú)需標(biāo)記并可用于蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)目標(biāo)識(shí)別的方法，可通過(guò)定量分析凝膠圖像來(lái)找到因結(jié)合藥物后熱穩(wěn)定性改變的靶蛋白，同時(shí)還可繪制融化曲線來(lái)證實(shí)陽(yáng)性變化。

3.4 高通量CETSA 技術(shù)的開(kāi)發(fā) 分析技術(shù)高通量是研究的一大優(yōu)勢(shì)，研究表明，高通量細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)（HT-CETSA）可以在96、384 和1536 孔微孔板內(nèi)進(jìn)行，并可聯(lián)合使用β-半乳糖苷酶、熒光素酶報(bào)告基因和AlphaLISA 均相酶聯(lián)免疫分析等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。HT-CETSA 方法還可通過(guò)劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)選化合物[32]。如今此方法已運(yùn)用于不少研究，雄激素受體（AR）是前列腺癌的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，然而在研究中缺乏相關(guān)細(xì)胞學(xué)方法來(lái)區(qū)分直接結(jié)合AR，或間接作用于AR 共調(diào)節(jié)因子的抑制劑，而Shaw J 等[33]利用HT-CETSA 解決了這個(gè)問(wèn)題。

3.5 其他 CETSA 可用MS、WB 或AlphaScreen 等技術(shù)對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行定量和檢測(cè)，但這些方法可能會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間和細(xì)胞；為了解決CETSA 對(duì)蛋白質(zhì)量需求高的問(wèn)題，Herledan A 等[34]開(kāi)發(fā)了名為細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移-聲學(xué)反相蛋白質(zhì)陣列的技術(shù)——CETSAaRPPA，該方法將CETSA 的優(yōu)點(diǎn)與納米聲學(xué)傳輸系統(tǒng)和反相蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，可以在小樣本的條件下同時(shí)分析多種藥物靶點(diǎn)，是一種快速、經(jīng)濟(jì)的方法。此外，Kawatkar A 等[35]還對(duì)CETSA 技術(shù)進(jìn)行了改良，表明在CETSA 的加熱步驟后用去污劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行提取，可以使CETSA 應(yīng)用于多種復(fù)雜膜蛋白的測(cè)定和分析。

4 總結(jié)與展望

CETSA 作為一種可以直接檢測(cè)靶標(biāo)參與狀況的技術(shù)，越來(lái)越多的應(yīng)用于藥物靶標(biāo)研究中，其在新藥研發(fā)、藥物評(píng)估與優(yōu)化，以及疾病治療等領(lǐng)域具有重要的理論指導(dǎo)意義和實(shí)用價(jià)值，近幾年來(lái)不少學(xué)者 也 提 出 了 2D -CETSA、MS -CETSA、SplitLuc CETSA、HT-CETSA 等技術(shù)改進(jìn)，并將CETSA 研究領(lǐng)域進(jìn)一步拓展到了基因表達(dá)等方面。

技術(shù)的進(jìn)步必然促進(jìn)科學(xué)的發(fā)展，此后可以借助CETSA 技術(shù)的各種新方法研究細(xì)胞內(nèi)針對(duì)性藥物作用和耐藥性機(jī)制，從而確定現(xiàn)有藥物是否適合個(gè)體患者。這對(duì)于開(kāi)展個(gè)性化治療的實(shí)現(xiàn)具有潛在應(yīng)用價(jià)值，并且完全有可能預(yù)先為臨床醫(yī)生提供確定的治療方案，這對(duì)確定像腫瘤一樣疑難疾病是否已經(jīng)產(chǎn)生某種抗藥性以及何種類型的治療可更適合特定病人的研究有極大幫助。此外，長(zhǎng)期受制于分子作用機(jī)制未明的中草藥和進(jìn)展緩慢的蛋白質(zhì)分子生物學(xué)的研究，可借助于CETSA 技術(shù)得到更好的發(fā)展。