哺乳動物雷帕霉素靶蛋白與衰老相關(guān)機制的研究

楊玉露，黃蕓

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科，武漢 430022)

衰老是自然界普遍存在、不可逆的生理功能逐漸退化的狀態(tài)，也是一種多因素共同作用的結(jié)果，既與個體壽命有關(guān)，又與年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生有關(guān)，如高血壓、動脈粥樣硬化、2型糖尿病、癌癥、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松、白內(nèi)障等[1]。衰老是一個不可逆轉(zhuǎn)的自然規(guī)律，引起了人們的廣泛關(guān)注。隨著人口老齡化的發(fā)展，衰老和年齡相關(guān)性疾病已成為當今最重要的公共問題。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與許多重要的分子信號通路，是調(diào)控細胞生長網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點，其通過整合能量和營養(yǎng)的信息，協(xié)調(diào)細胞成分的合成或分解[2]。mTOR抑制劑的研究起源于20世紀60年代，當時研究者在智利拉帕努伊島的土壤樣本中發(fā)現(xiàn)一種新的抗菌活性物質(zhì)，命名為雷帕霉素，又名西羅莫司，是大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有強大的抗真菌活性[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR可以延長哺乳動物生命周期并預防和延緩年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生[4-6]，這一發(fā)現(xiàn)激發(fā)了人們開發(fā)mTOR抑制劑作為延長人類壽命藥物的興趣?，F(xiàn)對mTOR信號通路控制壽命和影響衰老的潛在機制進行綜述，以期為延長壽命和治療年齡相關(guān)性疾病提供新的靶點。

1 衰老機制

衰老是一種永久性的細胞周期停滯狀態(tài)，按其機制可分為復制性衰老和應(yīng)激性衰老。其中復制性衰老由細胞分裂導致的端粒損傷引起，端粒是染色體末端具有保護作用的DNA-蛋白質(zhì)復合體，在細胞多次分裂增殖過程中不斷縮短，當其長度臨界最小值時，即引發(fā)DNA損傷反應(yīng)。而應(yīng)激性衰老往往不伴隨端粒長度的縮短或功能的喪失，而是由氧化應(yīng)激、癌基因激活、腫瘤抑制因子缺失等因素導致[7]。衰老細胞具有復雜的表型，如DNA損傷、細胞周期停滯、分泌相關(guān)因子、代謝異常、形態(tài)改變等，同時，細胞衰老也受到機體多重機制的調(diào)節(jié)[8]。mTOR是細胞生長代謝調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié)，參與細胞生長、增殖、存活、運動、自噬和蛋白合成，也參與細胞衰老的調(diào)節(jié)[9]。雖然胚胎期mTOR信號激活有利于胚胎生長發(fā)育，但當生長發(fā)育完成后，mTOR信號的過度激活會驅(qū)動衰老，導致與年齡相關(guān)的疾病和死亡，通過基因或藥物抑制mTOR可延緩衰老的發(fā)生[10-12]。

2 mTOR信號通路

mTOR是由FRAP1(FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1)單個基因編碼，是一種進化上保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族成員。mTOR主要通過兩種不同的蛋白質(zhì)復合體mTOR復合物(mTOR complex，mTORC)1和mTORC2行使其生理功能。其中mTORC1由3個核心成分構(gòu)成，分別是mTOR、mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白、哺乳動物致死因子半胱氨酸13蛋白8。而mTORC2主要由mTOR、雷帕霉素不敏感伴侶和哺乳動物致死因子半胱氨酸13蛋白8組成。mTORC1對雷帕霉素敏感，主要參與蛋白質(zhì)的合成、細胞的生長增殖、核糖體及線粒體的生物合成、自噬及新陳代謝，而mTORC2對雷帕霉素不敏感，主要參與調(diào)控細胞存活，并控制細胞骨架結(jié)構(gòu)和極性[13]。因目前關(guān)于mTORC2的研究有限，故本研究將主要圍繞mTORC1展開。

2.1mTORC1的上游調(diào)控 mTORC1是細胞響應(yīng)外界刺激、調(diào)節(jié)生長代謝和維持機體穩(wěn)態(tài)的中心，其激活依賴于生長因子、能量狀態(tài)和營養(yǎng)物質(zhì)，其中結(jié)節(jié)性硬化癥1/2復合體是參與調(diào)節(jié)mTORC1活性的最重要物質(zhì)。生長因子(如胰島素)可通過同源受體激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)，從而抑制結(jié)節(jié)性硬化癥1/2復合體，而后者可激活GTP酶，進而激活溶酶體表面小GTP結(jié)合蛋白腦組織富含的Ras同源物，最終導致mTORC1激活。細胞的能量狀態(tài)也是影響mTORC1活性的重要因素，在能量消耗或輕度缺氧條件下，細胞內(nèi)ATP水平降低可激活促分裂原活化的蛋白激酶，并導致結(jié)節(jié)性硬化癥1/2復合體磷酸化，抑制mTORC1活化[14]。環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，特別是亮氨酸和精氨酸，通過Rag亞家族Ras相關(guān)的小GTP酶與mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白相互作用，促進mTORC1的溶酶體定位，從而使mTORC1被腦組織富含的Ras同源物激活[15]。

2.2mTORC1的下游調(diào)控 激活的mTORC1通過磷酸化兩個關(guān)鍵的底物蛋白分子核糖體S6蛋白激酶1(S6 kinase 1，S6K1)和真核細胞始動因子4E結(jié)合蛋白1(4E binding protein 1，4EBP1)向下游傳遞信號[13]。一方面磷酸化的S6K1可進一步激活多種參與蛋白質(zhì)翻譯的蛋白因子，另一方面磷酸化的4EBP1與真核細胞起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)解離，啟動核糖體翻譯過程，進而增加翻譯效率和蛋白質(zhì)合成數(shù)量[13]。此外，mTORC1還有許多下游效應(yīng)物，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄激活因子4、氨基甲酰磷酸合成酶、unc-51樣自噬激活激酶1、轉(zhuǎn)錄因子EB，分別參與脂質(zhì)合成、核苷酸代謝和自噬調(diào)節(jié)等重要的生理生化反應(yīng)[16]。由此可見，mTORC1是細胞生長的正向調(diào)控因子，可激活合成代謝、抑制分解代謝，以滿足細胞生長和增殖需要。

3 mTORC1調(diào)控衰老的機制

3.1蛋白質(zhì)合成 蛋白質(zhì)合成是細胞生長所必需的生化反應(yīng)，受到mTORC1的嚴格調(diào)控。mTORC1通過磷酸化4EBP1和S6K1促進信使RNA翻譯和蛋白質(zhì)合成。在未磷酸化狀態(tài)下，4EBP1與eIF4E結(jié)合，阻礙翻譯的進行。經(jīng)mTORC1磷酸化后，4EBP1與eIF4E分離，從而形成激活的eIF4E復合體，上調(diào)含5′端寡聚嘧啶的信使RNA的翻譯。mTORC1結(jié)合、磷酸化激活核糖體S6K1，進而激活核糖體40S亞基S6蛋白，促進核糖體生物合成[2]。一般認為，衰老是一系列異常蛋白質(zhì)累積的過程，其最常見的分子特征與錯誤合成或不正確的翻譯修飾有關(guān)。抑制mTORC1的過度激活，減少異常蛋白質(zhì)的合成，可在一定程度上延緩衰老的發(fā)生[17]。Selman等[18]發(fā)現(xiàn)，基因特異性敲除S6K1小鼠的壽命延長，且年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生減少。肌少癥是與年齡增加相關(guān)的進行性全身肌量減少、肌肉強度和功能下降而引起的綜合征，Paturi等[19]采用蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，老年大鼠的肌肉萎縮和缺失與參與蛋白質(zhì)合成的蛋白磷酸化有關(guān)，包括Akt、mTOR、p70S6K和AMP活化的蛋白激酶，而且雄性大鼠表現(xiàn)這些差異似乎更為顯著。小膠質(zhì)細胞是大腦的免疫細胞在發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和損傷修復中發(fā)揮重要作用，而衰老小鼠的小膠質(zhì)細胞中4EBP1和S6K1磷酸化水平上調(diào)，與蛋白質(zhì)和炎癥細胞因子增加相關(guān)[20]。由此可見，蛋白質(zhì)合成增加是衰老的一種常見機制，可能構(gòu)成重要的治療靶點。

3.2自噬 自噬是由特定基因調(diào)控、依賴溶酶體的胞內(nèi)降解途徑，是一個高度調(diào)控和進化保守的分解代謝過程，與生長、發(fā)育、衰老、疾病狀態(tài)等過程密切相關(guān)。自噬不是簡單消除，而是作為一個動態(tài)系統(tǒng)，促進細胞更新并維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[21]。自噬降解廢棄或損壞的細胞成分，并將其回收為“備用的分子部件”，通過這個過程，老化的細胞得以清除損壞的蛋白質(zhì)或細胞器，從而實現(xiàn)自我更新。激活的mTORC1通過調(diào)控多種自噬相關(guān)蛋白的磷酸化，如unc-51樣自噬激活激酶1、抗T淋巴細胞球蛋白(anti-T-lymphocyte globulin，ATG)13、自噬調(diào)節(jié)因子和ATG14L，抑制自噬啟動和自噬小體形成，從而抑制自噬。此外，溶酶體是完成自噬的必要條件，而轉(zhuǎn)錄因子EB是溶酶體和自噬基因表達的主要調(diào)控因子，mTORC1可磷酸化并阻止轉(zhuǎn)錄因子EB的核定位，從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制自噬[22]。有研究表明，自噬可能隨著年齡的增長而下降，損傷的蛋白質(zhì)和細胞器(如線粒體)積累導致健康受損、壽命縮短，與衰老相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[23]。近年Shen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PADI4(peptidyl arginine deiminase type Ⅳ)通過介導Akt/mTOR信號通路，調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達，如ATG5、Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)BⅠ和LC3BⅡ，從而延緩阿爾茨海默病細胞衰老，保持細胞活性。中藥成分肉豆蔻提取物通過激活Akt-mTOR通路，導致自噬中間物質(zhì)p62增加和LC3BⅡ減少，從而防止衰老過程中骨骼肌質(zhì)量的損失[25]。近年來，自噬引起了研究者的極大關(guān)注，人們普遍認為，自噬的調(diào)節(jié)和維持是生命周期中的主要變化的基礎(chǔ)，mTOR抑制劑誘導并促進自噬過程在神經(jīng)退行性病變及其他衰老相關(guān)疾病中起十分重要的作用。

3.3衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP) SASP是指衰老細胞具有表達和分泌多種細胞調(diào)節(jié)劑的能力，如細胞因子、趨化因子、蛋白酶、生長因子和生物活性脂質(zhì)等[26]。SASP引起的炎癥損傷可破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，是細胞功能獨立的破壞因子和衰老的促進因子。核因子κB參與細胞對外界刺激的反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答過程中起重要作用，在衰老細胞中，多條信號通路匯合于核因子κB，進而激活多種促炎性細胞因子的基因表達，在這一復雜網(wǎng)絡(luò)中，mTOR也扮演重要角色。Laberge等[27]的研究表明，mTOR可以選擇性地增強膜結(jié)合細胞因子白細胞介素(interleukin，IL)-1A的翻譯，直接調(diào)節(jié)SASP的生成，從而破壞組織并導致與年齡相關(guān)的病變。相反，mTOR抑制劑雷帕霉素抑制了IL-1A的翻譯，降低了IL-6和其他細胞因子水平，可以改善衰老，并延緩年齡引起的炎癥性疾病的進展。心血管并發(fā)癥是腎移植患者死亡的高危因素，近年一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑依維莫司可阻止細胞促炎性細胞因子的釋放，延緩腎移植患者心血管老化[28]。Xia等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，短期和長期雷帕霉素治療均可使人牙齦成纖維細胞的IL-6和IL-8表達下降，進而增強其抗炎能力，從而延緩衰老的發(fā)生并調(diào)節(jié)衰老相關(guān)標志物的表達。SASP通過改變細胞微環(huán)境，導致細胞損傷和多種病理狀態(tài)的發(fā)生，已成為調(diào)節(jié)衰老的重要手段之一，為腫瘤和年齡相關(guān)性疾病的治療提供了新方向。

3.4細胞周期阻滯 衰老細胞區(qū)別于正常細胞最顯著的特征為細胞周期停滯。正常的細胞增殖需要經(jīng)歷G1、S、G2、M期。隨著細胞分裂次數(shù)的增加，端?？s短，DNA損傷，多個檢查點和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑被激活，細胞周期進程停止[29]。細胞周期蛋白與細胞周期蛋白依賴性激酶途徑是公認的細胞周期調(diào)控機制，p53/p21和p16/pRB是目前研究最為廣泛的分子靶點，且mTOR與上述途徑密切相關(guān)。p53是一種常見的抑癌基因，mTOR在體內(nèi)和體外均能提高p53的翻譯速度，從而放大p53的激活。因此，mTOR的過度激活會導致應(yīng)激條件下p53的大量積累并介導細胞周期停滯或凋亡[30]。在Tsc1基因缺陷的小鼠中，mTOR被異常激活，編碼細胞周期抑制劑的信使RNA含量顯著增加，包括p16、p19和p21，淋巴細胞生成相對減少，重建造血系統(tǒng)的能力受損，而雷帕霉素治療可以有效逆轉(zhuǎn)這一局面，并使其能夠有效對抗病毒感染[31]。此外，Zhu等[32]研究發(fā)現(xiàn)，甲基苯丙胺可通過抑制mTOR信號上調(diào)p53和p21，誘導細胞周期阻滯，進而誘導肺泡上皮細胞衰老。輔酶Q10是線粒體氧化呼吸鏈的重要組成部分，可下調(diào)mTOR，減少細胞周期抑制因子p16、p21、p53的表達，從而延緩D-半乳糖誘導的間充質(zhì)干細胞的衰老[33]。因此，在衰老過程中有許多調(diào)控蛋白通過mTOR對細胞周期進行調(diào)節(jié)，阻滯了正常的細胞周期，加速衰老進程。那么，如何合理利用這些調(diào)控蛋白延緩細胞衰老，值得進一步思考。

3.5干細胞活性 干細胞在參與組織修復和再生、維持正常組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。干細胞數(shù)量和功能的下降可能是年齡相關(guān)組織穩(wěn)態(tài)功能障礙的重要原因。有證據(jù)表明，mTOR在這一過程中起著核心作用，抑制mTOR可以保護甚至恢復多種組織中的干細胞功能[34]。如mTOR抑制劑雷帕霉素可增加腸道干細胞的數(shù)量和功能，促進干細胞的自我更新[35]。而神經(jīng)干細胞中mTOR異常可導致大腦發(fā)育嚴重缺陷，如自閉癥、癲癇發(fā)作、學習障礙和精神發(fā)育遲滯等?？梢?，mTOR及其下游信號分子在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化以及維持神經(jīng)干細胞活性中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[36]。盡管目前關(guān)于mTOR參與調(diào)控干細胞活性的研究正受到越來越多研究者的關(guān)注，但其具體分子機制尚未闡明，以miRNA為切入點不失為一種良好的嘗試。Zhang等[37]的最新研究顯示，經(jīng)典的降糖藥物二甲雙胍可以通過AMP活化的蛋白激酶/mTOR信號通路下調(diào)miR-34a-3p，進而緩解牙髓干細胞的衰老，有望為牙組織再生補充天然種子細胞，具有巨大臨床應(yīng)用潛能。然而，Romine等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，海馬體中神經(jīng)干細胞的數(shù)量顯著減少，使用氯胺酮短暫激活mTOR后可促進神經(jīng)發(fā)生，減輕衰老大腦的認知能力下降；Ramalingam等[39]的研究發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑雷帕霉素對放化療引起的骨髓抑制有不良影響，甚至造成造血系統(tǒng)的嚴重缺陷，與多數(shù)研究的結(jié)論相反，可能與mTOR的激活時間和藥物劑量以及機體功能狀態(tài)有一定關(guān)聯(lián)?？傊?，在評估m(xù)TOR抑制劑對老年群體的療效時，必須仔細考慮其潛在毒性。

3.6氧化應(yīng)激 許多研究表明，氧化和抗氧化機制之間的不平衡引起的氧化損傷是衰老過程中的一個關(guān)鍵因素[40]?；钚匝跏羌毎趸姿峄x的副產(chǎn)物，細胞衰老過程中活性氧的主要來源是線粒體，由于線粒體功能障礙，細胞內(nèi)活性氧水平急劇升高，導致DNA損傷[41]。mTOR可通過轉(zhuǎn)錄因子(YY1)-過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α控制線粒體氧化功能，以調(diào)節(jié)能量代謝，維持機體穩(wěn)態(tài)[42]。mTOR還可通過促進谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基的信使RNA及蛋白質(zhì)表達，提高細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的合成速度，進而維持細胞內(nèi)氧化還原平衡[43]。然而，氧化應(yīng)激和mTOR信號之間的相互作用極其復雜，mTOR不僅調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，而且受氧化應(yīng)激的反饋影響。有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號與氧化應(yīng)激直接或間接的相互作用，對糖尿病缺血再灌注心臟既有保護作用又有毒性作用，一方面，mTOR可增強線粒體清除功能，保護心肌免受氧化應(yīng)激誘導的細胞毒性損傷；另一方面，活性氧的產(chǎn)生又反過來激活mTOR，進而抑制自噬，減弱細胞對毒性物質(zhì)的清除能力[44]。在臨床上，氧化應(yīng)激與多種疾病均密切相關(guān)，故缺乏特異性，因此，針對不同的年齡相關(guān)性疾病，選用不同的具有代表性生物學標志物對指導臨床評價具有重要意義。

4 小 結(jié)

生物體的衰老是細胞衰老累積的結(jié)果，也是一個極其復雜的病理生理過程。近年來，人們致力于研究mTOR與機體衰老的內(nèi)在聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)mTOR調(diào)控的多個細胞代謝過程似乎以重疊但協(xié)調(diào)的方式延長壽命，延緩衰老。衰老細胞存在形態(tài)改變、增殖能力喪失、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加、DNA損傷反應(yīng)的激活以及細胞周期抑制物的水平增高等變化，但其衰老表型存在異質(zhì)性，故沒有一個單獨的標記可以在體外和體內(nèi)可靠地識別衰老細胞[45]。因此如何準確地評估衰老，以及如何恰當抑制mTOR信號從而延緩細胞或器官老化，仍是當今醫(yī)學界靶向治療的難點和熱點。所以，針對mTOR作用靶點，深入研究mTOR信號通路在衰老發(fā)生發(fā)展中的作用機制，研發(fā)新型抗衰老藥物，明確mTOR在年齡相關(guān)性疾病中的作用，對于減少年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生、延緩衰老、延長個體壽命具有重要意義。盡管目前不良反應(yīng)的出現(xiàn)阻止了其在健康個體中的應(yīng)用，但隨著研究的進一步深入以及精準醫(yī)學的發(fā)展，靶向mTOR途徑的藥物可能會廣泛用于減緩人類衰老和減少年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生。