中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與急性腎損傷研究進(jìn)展

熊號(hào)峰，劉景院

(國(guó)家傳染病醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100015)

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細(xì)胞在各種刺激因素作用后釋放的一種網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，可以直接捕獲微生物發(fā)揮生理作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，NETs如果生成過(guò)多或沒(méi)有及時(shí)清除，還可能引發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相關(guān)性小血管炎、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、囊性纖維病和癌癥等疾病[2]。NETs和細(xì)胞外組蛋白會(huì)通過(guò)多種不同的方式影響腎臟，導(dǎo)致各種類(lèi)型的腎臟損傷，包括急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)。AKI是指因各種原因?qū)е履I臟功能在數(shù)小時(shí)內(nèi)快速下降，主要表現(xiàn)為血清肌酐水平升高，進(jìn)行性尿量減少或兩者同時(shí)存在[3]，NETs可能通過(guò)不同的途徑影響AKI的發(fā)生和發(fā)展。本綜述總結(jié)了NETs不同組分導(dǎo)致腎臟損傷的機(jī)制，并分析了NETs與不同類(lèi)型AKI發(fā)生的關(guān)系。針對(duì)NETs相關(guān)的組織損傷機(jī)制來(lái)制訂治療策略可能有助于改善腎臟疾病的嚴(yán)重程度。

1 NETs的形成及釋放

1.1NETs、NET形成 中性粒細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫組成部分，可通過(guò)吞噬和分泌細(xì)胞因子的方式殺滅病原體[1]。2004年，Brinkmann等[4]發(fā)現(xiàn)在12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇刺激下，中性粒細(xì)胞可以釋放出一種直接捕獲微生物的網(wǎng)格狀纖維性結(jié)構(gòu)，稱為NETs。這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)主要以DNA為支撐結(jié)構(gòu)，其內(nèi)填充顆粒蛋白和肽類(lèi)等。NETs不斷形成的過(guò)程也被稱為NET形成，目前認(rèn)為這是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式。有研究表明，胞外誘捕網(wǎng)也可以從其他免疫細(xì)胞釋放，包括巨噬細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞[5]。

1.2NETs的合成及主要組分 在12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇激活中性粒細(xì)胞后，細(xì)胞核中組蛋白在肽酰精氨酸脫亞氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)的作用下發(fā)生瓜氨酸化，降低了DNA和組蛋白結(jié)合的緊密強(qiáng)度。其后，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶作用于組蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)解離[1,4]。解聚后的DNA、瓜氨酸化組蛋白和顆粒蛋白，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成NETs，進(jìn)而釋放到細(xì)胞外。NETs的主要組分為游離DNA、組蛋白、高遷移率族蛋白B1、乳鐵蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶、蛋白酶-3和組織蛋白酶G[6]。

1.3NETs的釋放 目前已知，NETs的釋放存在兩種不同的方式：①中性粒細(xì)胞發(fā)生死亡，染色質(zhì)及NETs相關(guān)蛋白質(zhì)通過(guò)破裂的細(xì)胞膜，釋放到細(xì)胞外。通常由12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、抗體、膽固醇晶體誘發(fā)，在刺激數(shù)小時(shí)后中性粒細(xì)胞死亡。②中性粒細(xì)胞不發(fā)生死亡，染色質(zhì)及NETs通過(guò)囊泡排出細(xì)胞外，細(xì)胞膜重新封閉[4-6]。細(xì)胞膜保持完整，仍具有趨向性及吞噬作用。通常由金黃色葡萄球菌通過(guò)補(bǔ)體受體或Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2，或通過(guò)大腸埃希菌作用于TLR4或TLR4激活的血小板誘導(dǎo)[7]。

2 NETs導(dǎo)致腎臟組織損傷的機(jī)制

盡管NETs是人體正常的先天性防御系統(tǒng)的一部分，但是NETs的組分可以直接或間接導(dǎo)致組織損傷和誘發(fā)機(jī)體自身免疫，因此NETs的過(guò)量生成或清除障礙可能對(duì)腎臟及其他臟器存在損害。研究表明，NETs具有潛在毒性，可以導(dǎo)致腎小球損傷[8]。中性粒細(xì)胞降解酶可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)使基底膜發(fā)生降解。而腎小管間質(zhì)損傷會(huì)導(dǎo)致腎小球血流量減少，從而更易產(chǎn)生NETs[9-11]。缺氧以及損傷可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞釋放組蛋白，繼而激化中性粒細(xì)胞生成更多NETs，并產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子釋放到血液，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)造成損害[8-9]。此外，NETs還可以通過(guò)激活補(bǔ)體的途徑而發(fā)生血管損傷，并通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腎臟纖維化[9]。NETs相關(guān)的腎臟疾病的組織損傷介質(zhì)主要包括DNA、組蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、自身抗體和補(bǔ)體等。

2.1DNA和組蛋白 NETs的游離DNA和組蛋白可激活凝血途徑，促進(jìn)凝血酶生成、血小板聚集、凝血酶原活性、P-選擇蛋白、磷脂酰絲氨酸和因子Ⅴ的表達(dá)而促進(jìn)凝血，同時(shí)抑制纖維蛋白溶解[12]。細(xì)胞外組蛋白具有細(xì)胞毒性，可引起內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致器官功能衰竭[13]。在體外研究中，細(xì)胞外組蛋白可致使腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞死亡[14]。同時(shí)，細(xì)胞外組蛋白還可以增加活性氧的產(chǎn)生，可募集中性粒細(xì)胞，并可產(chǎn)生更多的NETs，形成了有利于NETs產(chǎn)生的惡性循環(huán)[15]。

2.2中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶 Pieterse等[8]研究證明，在NETs相關(guān)的炎性疾病中，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、血管滲漏和纖維化過(guò)程之間存在聯(lián)系。內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬能力如果不足以處理過(guò)量形成的NETs，就會(huì)通過(guò)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶介導(dǎo)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白水解，導(dǎo)致細(xì)胞間連接破壞而發(fā)生血管滲漏，從而在水腫和蛋白尿的發(fā)展中發(fā)揮作用。此外，還可以通過(guò)β聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化通過(guò)改變細(xì)胞形狀、極性、運(yùn)動(dòng)性和產(chǎn)生膠原蛋白，可導(dǎo)致間質(zhì)纖維化，從而促進(jìn)腎臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展[16]。

2.3自身抗體 在多種腎臟疾病中普遍存在組蛋白、雙鏈DNA和中性粒細(xì)胞顆粒蛋白等NETs組分的自身抗原。此外，ANCA的自體抗原均是NETs組分[17]。當(dāng)自身無(wú)法清除與NETs相關(guān)的抗原時(shí)，炎癥組織損傷后新的細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)一步被釋放，因此每次疾病發(fā)作均會(huì)引發(fā)新的自身抗體產(chǎn)生和組織損傷[18]。NETs也增加T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原反應(yīng)并激活B細(xì)胞，以誘導(dǎo)免疫球蛋白和抗體產(chǎn)生[19]。盡管自身抗體可通過(guò)多種機(jī)制引起細(xì)胞損傷和免疫激活，但免疫復(fù)合物沉積是自身抗體導(dǎo)致發(fā)病的重要原因，它可以激活靶細(xì)胞通過(guò)Fc受體并引起吞噬作用，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放和細(xì)胞毒性。循環(huán)中含有DNA和抗雙鏈DNA抗體的IgG免疫復(fù)合物是導(dǎo)致腎炎的因素。自身抗體重鏈高變區(qū)尤其是高變區(qū)-3中的殘基以及抗體的同種型和亞類(lèi)決定了臨床腎炎的風(fēng)險(xiǎn)[20]。

2.4補(bǔ)體系統(tǒng) 有研究表明，C3和C3a受體缺陷型小鼠中性粒細(xì)胞不能形成NETs，補(bǔ)體系統(tǒng)與NET形成相關(guān)[21]。通過(guò)經(jīng)典或替代途徑引發(fā)的補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的調(diào)理作用對(duì)于NETs釋放至關(guān)重要。除C3外，過(guò)敏毒素C5a還通過(guò)上調(diào)TLR和補(bǔ)體受體來(lái)募集并激活中性粒細(xì)胞，從而增強(qiáng)NETs的釋放[22]。

3 NETs與不同類(lèi)型AKI發(fā)生的關(guān)系

NETs和細(xì)胞外組蛋白會(huì)通過(guò)多種方式影響腎臟，導(dǎo)致各種類(lèi)型的腎臟損傷。首先，當(dāng)腎臟出現(xiàn)感染時(shí)，NETs作為機(jī)體的一種防御因子發(fā)揮作用，同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致腎臟局部或者遠(yuǎn)隔臟器的損傷[14]。其次，NETs還可能導(dǎo)致各種形式的無(wú)菌壞死性炎癥、促進(jìn)微血管和大血管血栓形成。再次，如果NETs清除受損，機(jī)體可能產(chǎn)生針對(duì)NETs組分的自身免疫，例如ANCA和抗核抗體，進(jìn)而導(dǎo)致AKI的發(fā)生。AKI的病理表現(xiàn)通常包括腎小管損傷、腎血管功能障礙、過(guò)度炎癥和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[23]。

3.1NETs與缺血再灌注損傷導(dǎo)致的AKI 在缺血再灌注損傷中，NETs誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞死亡，通過(guò)血小板與中性粒細(xì)胞的相互作用促進(jìn)腎小管周?chē)?xì)血管形成血栓，并引發(fā)其他中性粒細(xì)胞的NET形成[24-25]。有研究表明，在缺血性AKI中，可檢測(cè)到循環(huán)和局部NETs和組蛋白水平的升高，同時(shí)PAD4在腎臟中的表達(dá)增加[26]。PAD4主要在中性粒細(xì)胞表達(dá)，在缺血再灌注損傷后的腎小管周?chē)?xì)血管、腎間質(zhì)間隙和腎小管中聚集，在AKI發(fā)生過(guò)程中釋放NETs[14]。使用藥理或遺傳方法抑制PAD4，減少了炎癥和NETs形成，可以防止動(dòng)物模型中的AKI發(fā)生；同時(shí)脫氧核糖核酸酶Ⅰ或抗組蛋白IgG促進(jìn)NETs的降解也減少了腎臟損傷。這些研究均表明了NETs形成在缺血性AKI發(fā)生中的重要性[14,24]。腎小管壞死和NETs形成還可以通過(guò)釋放組蛋白和細(xì)胞因子進(jìn)入血液循環(huán)而加劇遠(yuǎn)端器官功能障礙，這也是嚴(yán)重AKI的常見(jiàn)特征。

3.2NETs與溶血性尿毒癥綜合征引起的AKI 研究表明，在溶血性尿毒癥綜合征引起的AKI過(guò)程中也有NETs釋放，且與健康受試者相比，溶血性尿毒癥綜合征患者血漿中循環(huán)細(xì)胞游離DNA和核小體的含量增加[26]。NETs可促進(jìn)微血管系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和血栓形成，導(dǎo)致溶血性尿毒癥綜合征期間的腎衰竭。

3.3NETs與ANCA相關(guān)血管炎導(dǎo)致的AKI ANCA是以單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞胞質(zhì)成分髓過(guò)氧化物酶及蛋白水解酶3為靶抗原的自身抗體。ANCA相關(guān)性血管炎是一種壞死性血管炎，主要影響小血管。其以小血管壞死性炎癥、大量巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主要表現(xiàn)?？梢岳奂岸喾N器官(包括腎臟、肺、皮膚)以及外周神經(jīng)系統(tǒng)，預(yù)后差。主要病變類(lèi)型有韋格納肉芽腫病、顯微鏡下型多血管炎、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎、節(jié)段壞死性星月體性腎炎，統(tǒng)稱為ANCA相關(guān)性小血管炎[27]。

中性粒細(xì)胞可以被一系列促炎癥因子(白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β和脂多糖等)刺激而處于半激活狀態(tài)，中性粒細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶3、髓過(guò)氧化物酶抗原轉(zhuǎn)移至中性粒細(xì)胞表面。ANCA與蛋白水解酶3、髓過(guò)氧化物酶抗原結(jié)合后，激活了PAD4依賴的NETs釋放途徑[28]。此外，中性粒細(xì)胞激活后可以引起呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致具有致病活性的各種蛋白酶及活性氧的大量產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致NETs的釋放。氧自由基的釋放可同時(shí)促進(jìn)聚集的單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，而ANCA與中性粒細(xì)胞Fc受體Ⅲb型受體結(jié)合可以上調(diào)黏附分子，進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[19]。另外一些促炎癥因子(如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)又會(huì)增加中性粒細(xì)胞中蛋白水解酶3的表達(dá)，繼續(xù)與ANCA反應(yīng)。ANCA介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒后，使內(nèi)皮細(xì)胞直接暴露于蛋白酶的損傷中。除此之外，ANCA可以激活內(nèi)皮細(xì)胞，這些效應(yīng)包括使內(nèi)皮的通透性增高，使炎癥細(xì)胞和血小板更易黏附于內(nèi)皮細(xì)胞表面，并導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子增多，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷[29]。由此可見(jiàn)，ANCA及各種黏附、炎癥因子與內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及NETs之間互相影響，引起一系列免疫反應(yīng)，造成持續(xù)的血管壁或組織損傷。

3.4NETs與系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎 SLE是一種以大量自身抗體形成為主要特征的自身免疫性疾病。研究顯示，NETs形成過(guò)多及清除障礙可能參與SLE的發(fā)病機(jī)制，SLE患者體內(nèi)的NETs水平與SLE活動(dòng)度評(píng)分呈正相關(guān)[30-31]。SLE患者有獨(dú)特的中性粒細(xì)胞亞群，稱為低密度粒細(xì)胞，易于促炎性細(xì)胞因子釋放和自發(fā)性NET形成。這些細(xì)胞刺激漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生α干擾素。α干擾素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞的分化和血管生成。因此，在SLE發(fā)作期間，α干擾素介導(dǎo)的對(duì)成熟內(nèi)皮細(xì)胞及其前體的作用對(duì)腎臟脈管系統(tǒng)有害。中性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞的協(xié)同活性會(huì)通過(guò) α干擾素放大免疫失調(diào)、炎癥和組織損傷，這是SLE的重要發(fā)病機(jī)制[32]。

在NETs形成過(guò)程中，組蛋白、DNA和顆粒蛋白等自身物質(zhì)大量釋放，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗NET抗體而加重患者病情。SLE患者體內(nèi)的循環(huán)微?？稍鰪?qiáng)NET形成，這些微粒通常由凋亡細(xì)胞等形成。有研究表明，狼瘡腎炎的活動(dòng)性與循環(huán)游離DNA水平異常升高有關(guān)[33]。人體補(bǔ)體系統(tǒng)可識(shí)別和攻擊SLE患者皮膚、關(guān)節(jié)、小血管、腎小球等部位沉積的免疫復(fù)合物，從而導(dǎo)致不同部位發(fā)生急慢性炎癥反應(yīng)。SLE患者血清中的NETs清除下降與腎炎活動(dòng)(如蛋白尿、白蛋白水平和肌酐清除率降低)相關(guān)[32]。此外，SLE中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的NETs與缺氧、應(yīng)激反應(yīng)蛋白DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物4的上調(diào)以及自噬有關(guān)[34]?；钴S的SLE中性粒細(xì)胞釋放的NETs富含組織因子和白細(xì)胞介素-17A，它們可以促進(jìn)包括腎臟在內(nèi)的靶器官中的血栓形成、炎癥、組織損傷和纖維化。

3.5NETs與血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)導(dǎo)致的AKI TMA是一組由自身免疫性疾病、藥物、感染、妊娠等引起的以微血管血栓形成、溶血性貧血、血小板減少以及多器官受累的急性臨床病理綜合征[35]。一項(xiàng)包含90例患者的回顧性研究表明，共11例患者發(fā)展為移植相關(guān)TMA，血清NETs水平可以預(yù)測(cè)移植后發(fā)生TMA的趨勢(shì)；相對(duì)于基線，移植后4周或移植當(dāng)天血清NETs水平升高與移植相關(guān)TMA風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)；相反，血栓調(diào)節(jié)蛋白不利于預(yù)測(cè)移植相關(guān)TMA的發(fā)生；在這項(xiàng)研究中，2例移植相關(guān)TMA患者的腎小球中檢測(cè)到NETs沉積[36]。體外產(chǎn)生的NETs被健康供體的血漿有效降解。但是，NETs在接觸TMA患者血漿后仍保持穩(wěn)定。無(wú)法降解NETs與TMA血漿中脫氧核糖核酸酶活性降低有關(guān)。有效的NETs降解需要血漿脫氧核糖核酸酶1，TMA血漿顯示該酶水平降低。用重組人脫氧核糖核酸酶1補(bǔ)充TMA血漿可恢復(fù)NET降解活性[37]。

4 小 結(jié)

NET形成不僅僅是一種簡(jiǎn)單的宿主免疫防御機(jī)制，同時(shí)也驅(qū)動(dòng)了與無(wú)菌炎癥和自身免疫有關(guān)的病理生理狀況，導(dǎo)致各種AKI和慢性腎損傷，NET形成在腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展中起著重要作用。針對(duì)NETs相關(guān)的組織損傷機(jī)制來(lái)制訂治療策略可能有助于改善腎臟疾病的嚴(yán)重程度。由于NETs的組分及其釋放機(jī)制與每種疾病的獨(dú)特發(fā)病機(jī)制有關(guān)，且同時(shí)應(yīng)保持中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)感染的免疫保護(hù)作用，因此，應(yīng)針對(duì)每種疾病類(lèi)型制訂個(gè)性化干預(yù)措施。