CRISPR-Cas介導(dǎo)基因編輯技術(shù)的發(fā)展趨勢及研究進(jìn)展

楊永昌，常 帥，趙欣宇

（解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100010）

基因組編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展引起科學(xué)界的廣泛重視?；蚪M編輯技術(shù)與基因克隆技術(shù)差異很大，它的設(shè)計(jì)操縱簡便，可在特定位點(diǎn)進(jìn)行DNA序列的敲除、插入、突變等操作，對生物學(xué)的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用具有重大貢獻(xiàn)。

1 基因編輯技術(shù)

1.1 概述 目前常用的基因編輯技術(shù)有3種：真核轉(zhuǎn)錄因子的鋅指核酸酶（ZFN）[1]，轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶(TALEN）[2-3]和CRISPR-Cas系統(tǒng)，即聚集且規(guī)則的間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）和相關(guān)蛋白質(zhì)（CRISPR-associated，Cas）系統(tǒng)[4-5]。ZFN、TALEN 和 CRISPR-Cas系統(tǒng)同屬于人工核酸內(nèi)切酶（EEN）技術(shù)，用于基因組的定點(diǎn)編輯。

EEN的結(jié)構(gòu)包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA切割結(jié)構(gòu)域兩部分。分別用于特異性識別DNA和切割DNA以形成DNA雙鏈斷裂（DSB）。DSB可以修復(fù)內(nèi)源性的DNA損傷，包括非同源末端連接和同源性定向修復(fù),利用這個(gè)過程產(chǎn)生的基因突變進(jìn)行遺傳改造[6-7]。非同源末端連接的出錯(cuò)率較高，重復(fù)修復(fù)同一斷裂位點(diǎn)會導(dǎo)致DNA在靶點(diǎn)處的插入或缺失[8]，從而改變閱讀框，并使靶基因的表達(dá)遭到破壞，導(dǎo)致mRNA降解或產(chǎn)生非功能性蛋白，并達(dá)到基因敲除的結(jié)果[8-9]。同源性定向修復(fù)則通過含有來自外部的與DSB同源序列的模板DNA參與修復(fù)過程，并將目的基因連接到模板DNA上，然后將其整合到DSB的內(nèi)源性位點(diǎn)中，實(shí)現(xiàn)精確的基因組序列修改，即基因敲入[6]。

1.2 CRISPR-Cas技術(shù) CRISPR-Cas作為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，廣泛存在于細(xì)菌和古生菌的染色體上,與其免疫相關(guān)。當(dāng)外源病毒或質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，專門的Cas蛋白將外源DNA剪成小片段，并將它們粘貼到連續(xù)的DNA片段中，稱為CRISPR序列。然后，Cas蛋白表達(dá)并加工CRISPR基因座以產(chǎn)生CRISPR RNA（crRNA）。通過序列同源性，這些crRNA基于序列特異性將Cas復(fù)合物靶向到外源DNA，并切割目標(biāo)DNA以干擾外來入侵者。在基因編輯過程中，與ZFN和TALEN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建需要執(zhí)行蛋白融合過程相比，CRISPR-Cas技術(shù)利用設(shè)計(jì)的特異性向?qū)NA分子（sequence-specific guide RNA）作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域替代了蛋白融合過程，大大降低了技術(shù)難度，從而表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢。

2 CRISPR技術(shù)的發(fā)展及分類

2.1 CRISPR技術(shù)的發(fā)展 1987年，ISHINOY等[10]研究組在分析大腸桿菌iap基因及周邊序列時(shí)發(fā)現(xiàn)iap基因3'端含有29個(gè)核苷酸高度同源重復(fù)序列，它們被含32個(gè)核苷酸的序列間隔開。但當(dāng)時(shí)人們并不知道這些重復(fù)序列的作用。2000年，西班牙研究者M(jìn)OJICA FJ等[11]在多種微生物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)這類重復(fù)性序列。直到2002年，JANSENR等[12]觀察了大量細(xì)菌和古細(xì)菌基因組后，首次提出CRISPR，其代表了同一類特征明顯、排列整齊、秩序一致的重復(fù)序列，總稱為Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR。多個(gè)CRISPR相關(guān)基因則被命名為Cas（CRISPR-associated）家族。CRISPR序列用于微生物對噬菌體的免疫被BARRANGOUR等人證實(shí)[13]，并揭示出CRISPR序列在微生物中的主要功能。

嗜熱鏈球菌廣泛用于乳制品行業(yè)制作酸奶和奶酪，2007年，Danisco公司的Horvath與其同事試圖解決嗜熱鏈球菌免受噬菌體攻擊這一問題。他們通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRISPR系統(tǒng)確實(shí)是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)：嗜熱鏈球菌被病毒入侵后，它整合了來自噬菌體基因組中的一個(gè)新間隔序列，當(dāng)同一種病毒再次入侵時(shí)，細(xì)菌對其的攻擊便具有了抵抗力。如果改變特定間隔區(qū)序列，則會影響細(xì)菌抵抗噬菌體的免疫功能。他們還研究了Cas7和Cas9，認(rèn)為Cas9蛋白可能是產(chǎn)生這種免疫能力所必需的。2008年，John van der Oost研究團(tuán)隊(duì)率先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)錄成的小RNA，推測其可來自噬菌體的間隔序列，并稱該RNA為CRISPR RNA（crRNA），可引導(dǎo)Cas蛋白至靶DNA上；Marraffini和Sontheimer在同年證明了CRISPR-Cas系統(tǒng)的目標(biāo)分子是DNA，他們還明確指出，如果將CRISPR-Cas轉(zhuǎn)移到非細(xì)菌系統(tǒng)中，也可成為一種強(qiáng)悍的系統(tǒng)。2010年12月，Moineau團(tuán)隊(duì)證明了CRISRP-Cas9在PAM序列上游位置精確切割，使DNA雙鏈斷裂。而作為Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的顯著特征，Cas9是切割唯一需要的蛋白，它與crRNAs共同介導(dǎo)CRISPR-Cas9的干擾功能；2011年，Charpentier研究組對釀膿鏈球菌進(jìn)行了小RNA測序，發(fā)現(xiàn)除了crRNA以外，還有一種小RNA，稱為式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。tracrRNA通過24個(gè)核苷酸與crRNA中的重復(fù)序列互補(bǔ)配對與形成雙鏈，引導(dǎo)Cas9到其目標(biāo)DNA；至此，天然CRISPR-Cas9干擾機(jī)制的拼圖基本拼搭完整[14-15]。2011年7月，Siksnys團(tuán)隊(duì)從嗜熱鏈球菌（Ⅱ型系統(tǒng)）中克隆了整個(gè)CRISPR-CAS基因座，并在沒有Ⅱ型系統(tǒng)的大腸桿菌中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對質(zhì)粒和噬菌體DNA的靶向干擾；2012年6月和9月，Charpentier、Doudna團(tuán)隊(duì)與Siksnys團(tuán)隊(duì)，先后發(fā)表了CRISPR-Cas系統(tǒng)應(yīng)用于基因編輯的論文，他們在體外系統(tǒng)中證明了crRNA通過堿基互補(bǔ)配對與tracrRNA形成雙鏈RNA，指導(dǎo)Cas9蛋白在目標(biāo)DNA上切割，引起雙鏈斷裂，精確的平端切割點(diǎn)位于PAM上游3個(gè)核苷酸位置[16]。tracrRNA: crRNA在被融合為單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）時(shí)也可以發(fā)揮指導(dǎo)Cas9的作用，此外，crRNA可以減少到20nt，仍足以有效切割；通過改變crRNA的序列可以重新定位Cas9的靶向位點(diǎn)[15]。2016年，有研究發(fā)現(xiàn)一種來自纖毛菌（Leptotrichiashahii）的CRISPR酶Cas13a（C2c2）蛋白具有RNA介導(dǎo)的RNA酶功能，8個(gè)月后，他們又發(fā)現(xiàn)了另一種同類酶Cas13b[17]。目前為止，CRISPR技術(shù)在微生物混合篩選方面也有相關(guān)的應(yīng)用。

2.2 CRISPR技術(shù)的分類 根據(jù)Cas蛋白在細(xì)菌免疫防御過程中的不同功能，將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩大類：一類是單亞基蛋白完成特異性靶向及切割過程，其作用分子是相對單一的Cas蛋白，例如Ⅱ型Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白，目前該類系統(tǒng)僅發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中；另一類則是多亞基結(jié)構(gòu)的crRNA-蛋白復(fù)合體完成crRNA加工、靶向定位及剪切，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，該系統(tǒng)在細(xì)菌及古細(xì)菌中廣泛存在[18]。然而因CRISPR/Cas系統(tǒng)更為龐雜，因此還未得到廣泛應(yīng)用，而單亞基蛋白因其原理及操作淺易而被廣泛使用[19-20]。CRISPR/Cas技術(shù)于2013年正式用于DNA編輯修飾中，與ZFN和TALEN相比，該技術(shù)的性價(jià)比更為優(yōu)越[4]。它的不斷研究和發(fā)現(xiàn)給生物學(xué)的發(fā)展和臨床應(yīng)用帶來了巨大的變化。

3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)作用機(jī)理

CRISPR-Cas9系統(tǒng)并非天生就是為人類使用而產(chǎn)生的。它的本質(zhì)其實(shí)是細(xì)菌中一種對付病毒等外來DNA的防御系統(tǒng)。Cas9 蛋白是CRISPR系統(tǒng)中最常用的切割組件，在CRISPR系統(tǒng)的基因編輯過程中,首先被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的是tracrRNA、pre-crRNA和Cas9蛋白，然后tracrRNA會對precrRNA進(jìn)行修飾，通過啟動(dòng)RNA酶Ⅲ形成成熟的crRNA；最終crRNA、tracrRNA和Cas9 蛋白會形成復(fù)合物，通過識別crRNA將復(fù)合物靶向目標(biāo)DNA，同一時(shí)間，Cas9 蛋白被激活并發(fā)揮切割目的DNA的作用，最終可使DNA雙鏈斷裂從而產(chǎn)生DSBs[21]。DSB可以激活內(nèi)源性DNA損傷修復(fù)。簡化識別組件單鏈向?qū)NA（sgRNA）可取代crRNA和tracrRNA。在sgRNA的靶序列下游的PAM序列是確保復(fù)合體的成功識別的關(guān)鍵，PAM 位于靶向DNA 3′端后，可被sgRNA和Cas9蛋白復(fù)合體識別[22-23]。該系統(tǒng)經(jīng)過上述過程在生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因的敲除、敲入和替換等基因編輯操作，使生物體表現(xiàn)出與編輯前不同的特性，實(shí)現(xiàn)特定的生物學(xué)功能。

4 CRISPR基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

近年來，Science雜志曾多次將CRISPR技術(shù)及其相關(guān)成果評選為全球年度十大科技突破之一。CRISPR基因編輯技術(shù)不僅是理想的基因編輯工具，更為改造生物體提供了新的手段。

4.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用 2013年以來，很多科學(xué)家將CRISPR-Cas系統(tǒng)成功地應(yīng)用到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。其中，Church研究組設(shè)計(jì)了Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)，在人293T細(xì)胞、K562細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）中通過設(shè)計(jì)sgRNA成功靶向特定序列，且多個(gè)gRNA可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的多重編輯[5]。Qi研究組則建立了CRISPRi系統(tǒng)，將Cas9改造為失去核酸內(nèi)切酶活性的dCas9，通過sgRNA的指導(dǎo)定點(diǎn)結(jié)合到目標(biāo)基因座上，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)[24]。WUY等人利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對Crygc顯性突變的小鼠進(jìn)行基因治療使其獲得了健康的后代，為CRISPR-Cas9 系統(tǒng)用于遺傳疾病的基因治療提供了依據(jù)[25]。之后，MIZUNOS等人利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了酪氨酸酶基因(Tyr)突變的白化病小鼠模型[26]。

4.2 CRISPR-Cpf1的發(fā)現(xiàn) 2015年，CRISPR-Cpf1被發(fā)現(xiàn)。Cpf1蛋白是一種比spCas9蛋白更小更簡單的核酸內(nèi)切酶，自然形態(tài)下僅需要一條RNA引導(dǎo)。Cpf1蛋白切割DNA后產(chǎn)生黏性末端，便于新DNA序列插入。Cpf1識別富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，這也擴(kuò)展了基因編輯靶點(diǎn)的選擇范圍,也使得CRISPR-Cpf1系統(tǒng)在特異性和多基因編輯方面擁有了很大的優(yōu)勢。

4.3 Cas13RNA酶的發(fā)現(xiàn) 2016年，張鋒實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一種來自纖毛菌（Leptotrichiashahii）的CRISPR酶Cas13a（C2c2）蛋白，具有RNA介導(dǎo)的RNA酶功能。8個(gè)月后，他們又發(fā)現(xiàn)了另一種同類酶Cas13b，Cas13可以在不破壞DNA的情況下與RNA結(jié)合并切割RNA，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的自衛(wèi)[27]。且在cas13系列中的cas13b(C2c6)和cas13d也具有同樣的特征[28-29]。RNA水平的編輯是可逆及可變的。開發(fā)和利用動(dòng)態(tài)調(diào)控元件，控制該通路的調(diào)控程度及時(shí)間，將具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 CRISPR基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

隨著CRISPR基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大，特別是在生物的基因定點(diǎn)編輯、基因組篩選、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組成像、基因診療、生態(tài)應(yīng)用等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用，取得了突破性進(jìn)展。目前，基因編輯技術(shù)主要應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)與環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。

5.1 CRISPR/Cas9技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用 CRISPR/Cas9技術(shù)高效便捷的特點(diǎn)極大地縮短了修改傳統(tǒng)真核生物模型和細(xì)胞系基因組所需的時(shí)間，開啟了基因編輯技術(shù)領(lǐng)域新篇章，為第三代基因編輯技術(shù)。該技術(shù)可以在幾周到幾個(gè)月內(nèi)完成以前用改良的胚胎干細(xì)胞，耗時(shí)1～2年才能完成的基因敲除小鼠模型的構(gòu)建[30-31]。因此，CRISPR/Cas在生物學(xué)研究發(fā)展中最主要的應(yīng)用是動(dòng)、植物和細(xì)胞模型的建立。研究人員可以使用這些專門創(chuàng)建的模型來復(fù)制在人類中發(fā)現(xiàn)的基因變體[32]。同時(shí)，研究人員還可以利用這些疾病模型更加精確地研究疾病發(fā)生的機(jī)制，為其治療開發(fā)新的思路。有研究報(bào)道稱，通過Cas9介導(dǎo)的基因驅(qū)動(dòng)可以加速小鼠模型的產(chǎn)生，靈長類動(dòng)物模型同樣適用[33-34]。研究人員通過Cas9介導(dǎo)的基因編輯創(chuàng)建了亨廷頓舞蹈癥的豬模型，以研究這種特定動(dòng)物模型中的疾病[35]。2016年，Science雜志在同一期發(fā)表了3個(gè)研究機(jī)構(gòu)成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動(dòng)物模型的方法[36-38]。他們利用CRISPR系統(tǒng)編輯Dystrophin基因，能夠不同程度修復(fù)杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）小鼠的肌肉功能，從而達(dá)到治療DMD的效果。2018年，LONG C等人將肌營養(yǎng)不良患者的干細(xì)胞進(jìn)行修飾，最終使其健康表達(dá)[39]。此外，研究人員還使用CRISPR/Cas在特定細(xì)胞中進(jìn)行多種基因敲除，更快地模擬疾病用以研究其生物學(xué)過程[40-43]。

5.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在遺傳性疾病中的應(yīng)用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在遺傳性疾病治療的應(yīng)用中表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，主要?dú)w因于其強(qiáng)大的基因編輯能力。文獻(xiàn)報(bào)道的已應(yīng)用該技術(shù)治療的遺傳性疾病包括：杜氏肌營養(yǎng)不良[44]、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥[45]、Crygc基因突變引發(fā)的白內(nèi)障[46]、X連鎖慢性肉芽腫病[47]和囊性纖維化[48]等。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可以和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）技術(shù)相結(jié)合，可以為血友病B[49]、地中海貧血[50]以及鐮狀細(xì)胞性貧血[51]患者定制個(gè)性化治療方案。

5.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在其他疾病治療中的應(yīng)用 CRISPR/Cas9技術(shù)通過對免疫相關(guān)基因的編輯與免疫療法相結(jié)合，使其在相關(guān)疾病治療的領(lǐng)域中不斷取得突破性進(jìn)展。由于G蛋白偶聯(lián)因子超家族成員CCR5基因缺失的血細(xì)胞對人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）進(jìn)入具有抗性，CCR5基因已成為治療HIV-1感染的理想靶點(diǎn)[52]。研究表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)將供者CD34+成體造血干細(xì)胞的CCR5基因敲除，將其移植到HIV-1感染的患者中，便可穩(wěn)定重建造血系統(tǒng)，在之后的觀察中未發(fā)現(xiàn)基因編輯造成的脫靶及其他不良反應(yīng)，證明了CRISPR/Cas9治療AIDS和白血病的可行性和安全性[53]。除此之外,由于免疫檢查點(diǎn)分子PD-1可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡且只能在活化的T細(xì)胞中表達(dá)，敲除PD-1可以抑制細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，從而延長活化的T細(xì)胞的存活時(shí)間以完善CAR-T療法。用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除PD-1顯著增加了血液中免疫活性T細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而可以使腫瘤生長得到抑制[54]。

5.4 CRISPR/Cas9技術(shù)在農(nóng)業(yè)與環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用隨著CRISPR/cas9技術(shù)的快速發(fā)展，由于其操作簡單、高效、成本相對較低，使得該技術(shù)在農(nóng)作物育種、改良性狀等方面都顯現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢，通過調(diào)控基因的表達(dá)獲得農(nóng)作物高產(chǎn)、抗病、抗逆等優(yōu)良品種。目前，除了應(yīng)用于玉米、大豆等大型農(nóng)作物商品品種以外，研究人員已將其應(yīng)用于不同的物種，例如六倍體面包小麥和蘑菇等。

CRISPR/Cas9技術(shù)在環(huán)境科學(xué)等方面也具有巨大的應(yīng)用潛力。蚊蟲是瘧疾、登革熱、黃熱病、寨卡病等多種疾病的傳播媒介，有效防治蚊蟲可以大大減少蚊媒傳染病的發(fā)生。利用基因編輯技術(shù)開發(fā)的基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)將CRISPR/Cas9技術(shù)與基因驅(qū)動(dòng)結(jié)合是防治蚊蟲新方法。目前，科研人員正通過昆蟲不育技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、攜帶顯性致死基因昆蟲的釋放技術(shù)和基因改造技術(shù)降低了野外蚊蟲種群數(shù)量或傳播疾病的能力，控制蚊蟲及蚊媒傳染病，最終達(dá)到戰(zhàn)勝由蚊子傳播的疾病從而保護(hù)人類健康的目的。

6 CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的檢測

利用CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯后，將產(chǎn)生不同的突變，目前基因編輯位點(diǎn)檢測方法最常用的有3種[55]：Sanger測序的靶點(diǎn)檢測方法、T7E1法和高通量二代測序（NGS）。

6.1 Sanger測序的靶點(diǎn)檢測方法 在該方法中，編輯位點(diǎn)序列通過特定引物擴(kuò)增進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示為正常的純合子突變類型，若測序結(jié)果為雙峰，應(yīng)觀察雙峰位點(diǎn)是否從切割位點(diǎn)附近開始，然后構(gòu)建克隆T 載體，選取多個(gè)克隆進(jìn)行Sanger測序，從而獲得多種突變類型。此方法只適用于少量基因編輯的檢測，費(fèi)時(shí)且昂貴。

6.2 T7E1法 這種方法通過特異切割不匹配的分子來檢測突變。它可以識別和切割不匹配的異源雙鏈DNA，并檢測高達(dá)12nt的插入和刪除[56]。它適用于任何目標(biāo)序列，但其靈敏度較低。

6.3 高通量二代測序（NGS） 利用該技術(shù)，可對編輯物種的整個(gè)基因組進(jìn)行測序，以獲得所有序列信息。目前，該方法用于分析CRISPR-CAS系統(tǒng)的未命中率。通過全基因組測序可檢測多種細(xì)胞的基因序列信息，并將獲得的SNP、Indel和SNV進(jìn)行比較，以評估其編輯結(jié)果和缺失[57]。

7 總結(jié)與展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)為編輯動(dòng)植物和微生物的基因組提供了有力的工具，促進(jìn)了合成生物學(xué)的發(fā)展。該方法具有方便、快捷、高效等特點(diǎn)，已經(jīng)成為目前生物界最為新穎熱門的技術(shù)之一。作為革命性基因編輯工具，它擁有強(qiáng)大的修飾功能，在人類疾病治療中必將發(fā)揮重要作用。但對人類基因的修飾會引發(fā)一系列的類倫理問題，相關(guān)管理機(jī)構(gòu)應(yīng)給予足夠的重視，防止該技術(shù)可能帶來的負(fù)面影響。