溶瘤病毒在宮頸癌中抗腫瘤作用的研究進(jìn)展

周 影，耿志欣，孫 建，戚小艷，裴 兵

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 宿遷 223800）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性死亡的主要原因之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心報(bào)道，2020年全球約604 127例宮頸癌新發(fā)病例和341 831例宮頸癌死亡病例，其中，亞洲地區(qū)新發(fā)病例和死亡病例分別占比58.2%和58.5%[1]。高危人乳頭瘤病毒（hrHPV）感染、年齡、吸煙、分娩、使用口服避孕藥等因素均與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)，hrHPV的持續(xù)性感染是宮頸癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因子。當(dāng)宮頸上皮被hrHPV感染后，宿主的腫瘤抑制因子被沉默，促癌因子功能紊亂，基因組發(fā)生改變，從而加速了宮頸癌的癌癥進(jìn)展[2]。癌蛋白E5、E6和E7是由HPV基因組編碼產(chǎn)生的蛋白，是正常宮頸上皮癌變的主要驅(qū)動(dòng)因素。E6和E7分別靶向pRb和p53通路[3]，而pRb和p53通路的相互作用影響著腫瘤進(jìn)展且與腫瘤的惡性表型密切相關(guān)，因此，E6、E7成為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)和重要攻克目標(biāo)。

溶瘤病毒（OVs）是具有復(fù)制能力的病毒，它能夠選擇性殺死腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)損傷作用[4]。溶瘤病毒可分為兩類(lèi)：一類(lèi)為天然病毒株，能夠特異性地靶向腫瘤細(xì)胞并在其中選擇性復(fù)制，如新城疫病毒、黏液瘤病毒、呼腸孤病毒等；另一類(lèi)為基因工程病毒株，通過(guò)增強(qiáng)病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮復(fù)制作用的基因并刪除其在正常細(xì)胞中發(fā)揮復(fù)制作用的重要基因從而靶向腫瘤細(xì)胞，如單純皰疹病毒、麻疹病毒、腺病毒等[5]。溶瘤病毒經(jīng)歷“野生毒株的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用”“基因改造病毒株的研發(fā)”“基因插入聯(lián)合治療”這3個(gè)階段后，現(xiàn)有的溶瘤病毒技術(shù)已發(fā)展至第3代，第3代溶瘤病毒發(fā)展較為成熟，不但具有腫瘤特異性，而且具有免疫調(diào)節(jié)與免疫治療功能[6]。病毒特異性感染腫瘤細(xì)胞后使腫瘤細(xì)胞溶解，被溶解的腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤相關(guān)抗原和損傷相關(guān)的分子模式信號(hào)，這些信號(hào)進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體內(nèi)初始T細(xì)胞的激活和樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步觸發(fā)機(jī)體內(nèi)獲得性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，主要包括抗病毒和抗腫瘤的免疫反應(yīng)[7]。

目前，臨床上越來(lái)越多地醫(yī)生使用溶瘤病毒應(yīng)用于癌癥患者的抗腫瘤治療，其中應(yīng)用最為廣泛的是溶瘤單純皰疹病毒、溶瘤腺病毒等，在宮頸癌的治療方面，也有文獻(xiàn)報(bào)道溶瘤病毒對(duì)宮頸癌的癌癥進(jìn)展有抑制作用，本文對(duì)此進(jìn)行綜述。

1 單純皰疹病毒（HSVs）

單純皰疹病毒分為1(HSV-1)型和2(HSV-2)型，溶瘤HSV-1(oHSV-1)病毒開(kāi)展的臨床數(shù)量較多。嗜神經(jīng)性的HSV-1為雙鏈DNA病毒，由包膜、被膜、衣殼和核心等結(jié)構(gòu)構(gòu)成球形顆粒[8]。HSV-1基因組由2個(gè)長(zhǎng)片段UL和2個(gè)短片段US構(gòu)成，2個(gè)片段分別占比82%和18%，US和UL的多種連接方式構(gòu)成HSV基因組的4種同分異構(gòu)形式[9]。研究發(fā)現(xiàn)，HSV的同分異構(gòu)體對(duì)病毒的增殖能力無(wú)顯著影響。HSV-1基因可編碼近100種蛋白，最先轉(zhuǎn)錄的基因?yàn)闃O早期基因（IE），IE主要包括與感染細(xì)胞蛋白（ICP）相關(guān)的基因，如ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47[10]。以ICP0為例，該基因與泛素連接酶E3功能一致，對(duì)病毒基因的表達(dá)起調(diào)控作用，它是HSV-1在正常細(xì)胞中低表達(dá)和低復(fù)制的必要蛋白[11-12]。IE的表達(dá)產(chǎn)物能夠激活早期基因（E）和晚期基因（L）的轉(zhuǎn)錄，IE、E及L基因的順序激活是HSV-1感染所必需的。此外，HSV-1能夠在神經(jīng)細(xì)胞中大量增殖這與ICP34.5(γ34.5)基因的存在密切相關(guān)。ICP34.5為雙拷貝基因，與神經(jīng)毒力有關(guān)。HSV-1在神經(jīng)細(xì)胞中的增殖受到ICP34.5編碼產(chǎn)物的影響[13]，而缺失ICP34.5基因的HSV-1優(yōu)先選擇在RAS蛋白活躍狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制[14]。HSV-1病毒通過(guò)自身的包膜糖蛋白、編碼一系列基因、阻斷樹(shù)突細(xì)胞對(duì)病原體的識(shí)別、抑制細(xì)胞的自噬和凋亡等方式逃避機(jī)體的體液免疫和宿主的抗病毒免疫監(jiān)測(cè)。

G207是最早在臨床試驗(yàn)中開(kāi)展的溶瘤病毒之一，它通過(guò)刪除ICP34.5基因和插入LacZ基因使得病毒在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制和傳播[15-16]。G207可誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫，這與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活有關(guān)。布蘭克等人通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了低劑量的G207能夠降低嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下宮頸癌C33a腫瘤的體積，并且，在瘤體內(nèi)注射G207后，42%的腫瘤被徹底根除[17]。

G47△是在G207基礎(chǔ)上進(jìn)行增強(qiáng)的3代溶瘤病毒，其基因組的最大特征是保留了G207的安全特性。該溶瘤病毒的基因組內(nèi)不僅包含RL1和ICP47突變，還在編碼核糖核酸還原酶大亞基的ICP6基因處插入LacZ基因使ICP功能失活，繼而誘導(dǎo)溶瘤HSV病毒在增殖細(xì)胞中的單一性復(fù)制[4]。此外，ICP47的突變使得MHC-I表達(dá)增強(qiáng)，繼而有效激活宿主的抗腫瘤反應(yīng)?；诖耍珿47Δ可能比G207毒性更小且更安全[18-19]。研究者們通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證G47Δ對(duì)實(shí)體腫瘤的影響，結(jié)果表明，G47Δ能夠徹底殺死癌癥干細(xì)胞，包括肝細(xì)胞癌、神經(jīng)鞘瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌等[18]。KAGABU M等人對(duì)G47Δ在宮頸癌中的效應(yīng)進(jìn)行探索，研究發(fā)現(xiàn)，G47Δ對(duì)三株宮頸癌細(xì)胞株（SKGⅢa）均有殺傷能力，且在HeLa宮頸癌細(xì)胞異種移植模型中，G47Δ明顯抑制腫瘤體的生長(zhǎng)，且與對(duì)照組相比，G47Δ治療組小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞前體數(shù)量顯著增加[6]。

2 腺病毒（Ads）

腺病毒是150 nm左右、無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒顆粒，其大小約為36 kb，能夠編碼早期和晚期基因。Ads的衣殼由3種主要蛋白質(zhì)（六鄰體、五鄰體堿基和纖維）和4種次要蛋白質(zhì)（Ⅲa、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ）組成[20]。病毒感染細(xì)胞時(shí)，Ads的纖維結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞表面受體相互作用，病毒通過(guò)五鄰體堿基上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序與細(xì)胞整合素（主要是αV3和αV5）結(jié)合而內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。在衣殼中，Ads的早期和晚期基因在宿主細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)病毒的裝配并從細(xì)胞中釋放。因?yàn)锳ds在人群中廣泛存在，機(jī)體內(nèi)含有Ads相關(guān)的抗體，這是溶瘤Ads的一大缺點(diǎn)，研究者們通過(guò)應(yīng)用蜂窩載體、聚合物包裹Ads等方式解決了這一問(wèn)題[21]。人類(lèi)細(xì)胞表面的Ads受體為整聯(lián)蛋白受體，它們可以轉(zhuǎn)導(dǎo)和感染分裂和非分裂細(xì)胞等多種細(xì)胞類(lèi)型。Ads載體在機(jī)體內(nèi)以游離DNA形式存在，確保其不會(huì)整合至宿主的基因組中，這是Ads安全性的體現(xiàn)。新一代Ads載體能夠裝載高達(dá)37 kb的外源基因，這為腺病毒在臨床的應(yīng)用提供更多可能。Ads自身具有強(qiáng)大的免疫原性使其成為溶瘤應(yīng)用地理想物質(zhì)，溶瘤Ads通過(guò)基因編輯后在正常組織中的復(fù)制減少，在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制持續(xù)增加，使得癌細(xì)胞被裂解。一旦被感染的腫瘤細(xì)胞被裂解，腫瘤細(xì)胞釋放的病毒后代會(huì)感染鄰近的癌細(xì)胞，血液也成為病毒顆粒的“助手”，協(xié)助其在體內(nèi)完成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[20]。溶瘤病毒還通過(guò)釋放腫瘤相關(guān)抗原來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)[22-23]。

Ad5-Δ24RGD溶瘤病毒，在其基因組中，E1A蛋白結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)2有24 bp的缺失，E1A蛋白這一結(jié)構(gòu)域賦予Ads誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期的能力。因此，E1A蛋白結(jié)構(gòu)域缺失部分堿基片段后使得細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行增殖。此外，有研究稱(chēng)腫瘤組織中柯薩奇 - 腺病毒受體（CAR）表達(dá)降低，為了避免宮頸癌中CAR的缺陷和提高Ad5-Δ24RGD在腫瘤治療過(guò)程中的效應(yīng)，Suzuki K等人將結(jié)合了精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 (RGD-4C)基序的 αvβ3及 αvβ5整合素合并到旋鈕域的HI循環(huán)上[24]。Pasqualini R等人證實(shí)RGD及RGD修飾的Ads能夠與腫瘤細(xì)胞自身表達(dá)的αvβ3和αvβ5有效結(jié)合，并且，RGD修飾已被證實(shí)可以在體內(nèi)和體外對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)揮治療作用[25]。Ad5-Δ24RGD體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有溶瘤活性且對(duì)小鼠晚期宮頸癌有治療作用，在評(píng)估Ad5-Δ24RGD是否能夠抑制宮頸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，靜脈注射一定劑量的Ad5-Δ24RGD可以有效減少瘤體的生長(zhǎng)且無(wú)毒性作用[23]。

M6是源自野生型腺病毒血清型5的新型E1A突變的溶瘤腺病毒。M6的E1A CR2區(qū)域內(nèi)有27 bp的缺失，使得該溶瘤腺病毒能夠廣泛地在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行選擇性復(fù)制。M6中的另一個(gè)生物工程組件是將反義HPV16 E6 E7 DNA插入E3 6.7K/gp19K區(qū)，促進(jìn)反向HPV16 E6 E7 cDNA優(yōu)先在HPV相關(guān)宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)，從而沉默HPV16 E6 E7蛋白。在HPV相關(guān)的宮頸癌細(xì)胞中，pRb被HPV癌蛋白E7功能性滅活，且M6的病毒復(fù)制將放大HPV相關(guān)宮頸癌細(xì)胞中反義 HPV16 E6 E7的拷貝，并允許病毒感染擴(kuò)散到附近的腫瘤細(xì)胞。WANG W等人通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了經(jīng)由M6轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞（一種HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞）中HPV16 E6、E7蛋白的表達(dá)受到特異性抑制，此外，M6轉(zhuǎn)染在SiHa細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)凋亡[3]。

3 新城疫病毒（NDV）

新城疫病毒（NDV）為單股負(fù)鏈RNA病毒，是天然溶瘤病毒之一，隸屬于副黏病毒亞科的禽副黏病毒屬[26]。NDV毒株包含3種無(wú)毒力減毒毒株，分別為Ulster、LaSota和 Hitchner B1毒株。NDV基因組的6種結(jié)構(gòu)基因可以編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核蛋白、磷蛋白、融合蛋白、基質(zhì)蛋白、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白和RNA聚合酶蛋白。NDV感染宿主過(guò)程中，血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白和融合蛋白發(fā)揮主要作用，前者對(duì)細(xì)胞受體的識(shí)別、對(duì)病毒吸附細(xì)胞膜的介導(dǎo)作用及后者促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合、促使病毒穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，NDV對(duì)腫瘤的治療作用主要?dú)w因于以下幾點(diǎn)：①NDV在腫瘤細(xì)胞中增殖并對(duì)其進(jìn)行裂解，以完成對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接清除[29]；②血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白既能夠使腫瘤細(xì)胞表面抗原充分暴露又能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的黏附力，以激活機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[30]；③由NDV刺激產(chǎn)生的IFN-α、TNF-α、IL、集落刺激因子等細(xì)胞因子激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和致敏T細(xì)胞，以發(fā)揮ADCC效應(yīng)、破壞腫瘤細(xì)胞、特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[31]；④NDV抑制腫瘤微血管的形成切斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給，最終達(dá)到間接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[32-33]。

KESHAV RZ M等人使用表達(dá)人乳頭瘤病毒16(HPV-16)E6/E7癌蛋白的宮頸癌TC-1細(xì)胞系開(kāi)展NDV的溶瘤效果研究，他們發(fā)現(xiàn)，溶瘤NDV LaSota菌株在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制、產(chǎn)生ROS、激活早期細(xì)胞凋亡途徑等方式誘導(dǎo)宮頸癌TC-1細(xì)胞的凋亡[34]。據(jù)NEJAD A SM等人報(bào)道，HB1 NDV毒株的感染可通過(guò)上調(diào)caspase-3和LC3 - Ⅱ的表達(dá)，以劑量依賴(lài)的方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡和自噬。此外，NEJAD A SM等人還發(fā)現(xiàn)NDV能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生、增加細(xì)胞色素C的水平及下調(diào)存活蛋白水平，最終發(fā)揮抗腫瘤的治療效果[35]。

4 辛德畢斯病毒（SIN）

辛德畢斯病毒（SIN）是隸屬于披膜病毒科甲病毒屬的單股正鏈RNA病毒[36]。SIN基因組進(jìn)入細(xì)胞后翻譯成4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白主要包含Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4，結(jié)構(gòu)蛋白主要包含衣殼蛋白C、E3多肽、E2糖蛋白、6K多肽和E1糖蛋白。Nsp1與宿主細(xì)胞膜相互作用，繼而與內(nèi)涵體和溶酶體親和，這表明Nsp1與RNA復(fù)制子復(fù)合體的形成密切相關(guān)；Nsp2蛋白內(nèi)包含幾個(gè)重要的突變位點(diǎn)，對(duì)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要；E2和E3的突變致使SIN感染性恢復(fù)和毒性增加。研究發(fā)現(xiàn)，SIN在受感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可能誘導(dǎo)凋亡[37-38]。

將外源序列與編碼口蹄疫病毒2A蛋白酶的基因相連后插入SIN病毒衣殼與E3基因之間的框架內(nèi)，這是表達(dá)融合蛋白的重組SIN病毒，在2A蛋白酶的作用下，該融合蛋白與綠色熒光蛋白相連成為表達(dá)GFP的重組SIN病毒（TR339-GFP/2A）[39]。UNNOY等人通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)探索TR339-GFP/2A病毒對(duì)宮頸癌疾病的作用，結(jié)果表明，TR339-GFP/2A對(duì)正常人角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡無(wú)誘導(dǎo)作用，而對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLaS3和C33A有誘導(dǎo)病變和促進(jìn)凋亡的作用；在裸鼠中，靜脈注射TR339-GFP/2A后，異種移植的宮頸癌瘤塊體積減小甚至消退，對(duì)裸鼠進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)，TR339-GFP/2A可致遠(yuǎn)處腫瘤的壞死；GFP蛋白成像系統(tǒng)表明TR339-GFP/2A對(duì)腫瘤具有特異性靶向的作用[40]。

溶瘤病毒療法是治療惡性腫瘤的新型實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)對(duì)其基因組進(jìn)行編輯以提高其抗腫瘤效果，包括：靶向腫瘤細(xì)胞和插入特定的治療性轉(zhuǎn)基因，該病毒對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)作用而能夠特異性地靶向腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或誘導(dǎo)其凋亡，最終發(fā)揮抗腫瘤的作用[41]?？v觀溶瘤病毒的發(fā)展史，小核糖核酸病毒Rigvir是國(guó)外第一個(gè)獲批用于癌癥溶瘤治療的產(chǎn)品[42]；上海雙威生物科技有限公司開(kāi)發(fā)的H101是國(guó)內(nèi)首個(gè)獲得GMP證書(shū)的溶瘤病毒，該病毒可用于鼻咽癌聯(lián)合化療，且于2006年成功上市[43]，但H101的臨床療效未得到國(guó)際認(rèn)可；用于黑色素瘤患者局部治療的HSV-1型溶瘤病毒T-vec是首個(gè)獲得國(guó)際認(rèn)可的溶瘤病毒[44]。在宮頸癌的溶瘤治療方面，目前已獲得臨床許可的僅有重組人PD-1抗體HSV，可用于實(shí)體腫瘤的治療[45]。

上文所述的幾種溶瘤病毒雖尚無(wú)相關(guān)的臨床研究報(bào)道其對(duì)宮頸癌的抗腫瘤效應(yīng)，但其在其他疾病中的作用已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，例如：FRIEDMAN GK等人通過(guò)隊(duì)列研究驗(yàn)證了G207在兒童膠質(zhì)瘤治療過(guò)程中的抗腫瘤作用[46]，結(jié)果表明，G207對(duì)延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者生存期有顯著作用；G47Δ明顯改善惡性、復(fù)發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后，并將其年生存率提高至92.3%，這是G47Δ抗腫瘤特性的直接證據(jù)。雖然目前溶瘤病毒用于癌癥治療尚處于初步階段，但我們?cè)诖罅炕A(chǔ)實(shí)驗(yàn)中看到其作為臨床靶向腫瘤治療的巨大潛力，伴隨著臨床試驗(yàn)的相繼開(kāi)展，溶瘤病毒有望成為治療人類(lèi)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的新興藥物。

5 結(jié)語(yǔ)

溶瘤病毒在抗腫瘤的過(guò)程中誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，因此，在未來(lái)的研究中將其與免疫療法相結(jié)合，有望進(jìn)一步提高其療效。通過(guò)對(duì)溶瘤病毒的基因組進(jìn)行編輯，研究者們也將會(huì)開(kāi)發(fā)出更多具有抗腫瘤功能的溶瘤病毒，并且可以針對(duì)癌癥的類(lèi)型和階段選擇合適的病毒基因組編輯方式。最后，希望溶瘤病毒這一新型療法能夠改善宮頸癌患者的預(yù)后，能夠降低亞洲地區(qū)宮頸癌疾病的致死率。