納米酶?jìng)鞲衅髟诜治鰴z測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

＊杭永正 江蘭 鄒立娜 潘洪志 馬宏坤* 榮勝忠

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 黑龍江 157011 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 黑龍江 157011 3.上海健康醫(yī)學(xué)院協(xié)同科研中心 上海 201318）

天然酶作為一種生物催化劑可以高效催化生物體內(nèi)的多種化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)新陳代謝、營養(yǎng)和能量轉(zhuǎn)換等過程。但是，多數(shù)天然酶為蛋白質(zhì)，容易受到蛋白酶抑制劑的影響降低催化活性，同時(shí)對(duì)環(huán)境要求較高，需要在溫和的作用條件下才能發(fā)揮高效的催化能力，在高溫、低溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件下催化活性顯著降低甚至失活。納米酶是一種通過化學(xué)方法合成的人工酶，既保留酶的催化活性，又克服了天然酶的缺陷，具有易合成、穩(wěn)定性高、成本低、易存儲(chǔ)等諸多優(yōu)點(diǎn)[1]。自發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米粒子具有類過氧化物酶活性（POD）后[2]，納米酶引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，越來越多的納米酶被合成或改進(jìn)性能。酶?jìng)鞲衅魇菍⒚缸鳛樯锩舾性?，通過換能器將目標(biāo)物與酶相互作用產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)換為可測(cè)量的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的定量檢測(cè)。納米酶的優(yōu)異性能突破了天然酶在組裝傳感器中的局限，形成的納米酶?jìng)鞲衅魇艿綄W(xué)者的廣泛關(guān)注，已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。為此，本文綜述了納米酶材料的種類，重點(diǎn)綜述了納米酶?jìng)鞲衅髟诜治鰴z測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展。

1.納米酶材料

(1)貴金屬納米酶

貴金屬納米酶在不同條件下可表現(xiàn)類POD、類氧化酶（OXD）、類過氧化氫酶（CAT）和類超氧化物歧化酶（SOD）等活性。Li等發(fā)現(xiàn)Au、Ag和Pt等金屬具有類POD和類CAT活性，并通過實(shí)驗(yàn)詳細(xì)報(bào)告了Au、Ag和Pt的類POD和類CAT活性的催化機(jī)制，Au、Ag和Pt表面均能夠吸附H2O2，在酸性和中性條件下顯示出類POD活性，而在堿性條件下，H2O2傾向于酸式分解，表現(xiàn)出類CAT活性。此外，Chen等發(fā)現(xiàn)金納米粒子（AuNPs）可表現(xiàn)葡萄糖氧化酶活性催化葡萄糖，反應(yīng)過程與天然葡萄糖氧化酶相似。

(2)金屬氧化物納米酶

金屬氧化物價(jià)態(tài)的轉(zhuǎn)換是實(shí)現(xiàn)類POD活性的關(guān)鍵。Wang等通過有類POD活性的Fe3O4磁性納米顆粒（Fe3O4MNPs）去除有機(jī)污染物，研究了Fe3O4MNPs類酶活性的催化機(jī)理，發(fā)現(xiàn)Fe2+和Fe3+為反應(yīng)活性位點(diǎn)，當(dāng)H2O2分子吸附在Fe3O4MNPs表面時(shí)，F(xiàn)e2+和Fe3+激活H2O2生成羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-）/氫氧自由基（HO2·），誘導(dǎo)羅丹明B的降解和礦化。Wang等提出了一種發(fā)揮類SOD活性的CeO2納米粒子的催化循環(huán)機(jī)制，HO2·吸附在CeO2表面后生成O2和H2O2，H2O2通過自身氧化分解形成氧自由基將Ce4+還原為Ce3+。此外，多種金屬氧化物均被證實(shí)具有類酶活性（如MnO2、V2O5、TiO2、NiO2等）。

(3)碳基材料納米酶

碳基納米材料包括石墨烯、碳量子點(diǎn)（GQDs）和碳納米管等,具有穩(wěn)定性高、易于修飾、生物相容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，備受研究者關(guān)注。Zhao等探討了碳基納米材料催化活性的自由基機(jī)理，認(rèn)為羧基（-COOH）是催化活性位點(diǎn)，碳基材料的-COOH被氧化為過氧羧基（-COOOH）并伴隨H2O2分解，進(jìn)而（-COOOH）均裂生成·OH催化氧化3,3’，5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生顏色變化。Sun等分別使GQDs衍生物上的羰基（C=O）、羥基（O=C-O）、-COOH失活來探究其作為類POD的催化活性位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C=O失活后GQDs催化活性顯著降低，而C-OH失活后GQDs有較高的催化活性，故認(rèn)為C=O是催化活性位點(diǎn)，C-OH可以抑制催化反應(yīng)。

2.納米酶?jìng)鞲衅髟诜治龌瘜W(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

納米酶具有易合成、催化活性好、穩(wěn)定性高、成本低、易存儲(chǔ)等諸多優(yōu)點(diǎn)，解決了天然酶組裝傳感器的缺陷。納米酶?jìng)鞲衅饕褟V泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物、小分子物質(zhì)、重金屬離子、細(xì)菌和蛋白質(zhì)等的分析檢測(cè)。

(1)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)

①納米酶電化學(xué)傳感器。癌胚抗原（CEA）是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，常作為肺癌、胰腺癌、乳腺癌等的常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。Wang等[3]制備了花狀過渡金屬衍生物MMoO4（M=Co,Ni）作為電極基底材料，可為錨定抗體提供大量結(jié)合位點(diǎn)，使用中空硅納米粒子負(fù)載Cu2+和透明質(zhì)酸（HA）固定二抗（HMSNs-Cu2+@HA-Ab2），CEA可與HMSNs-Cu2+@HA-Ab2特異性結(jié)合固定到電極表面。在酸性條件下HMSNs-Cu2+@HA-Ab2釋放Cu2+激活底物材料的類POD活性，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，基于此構(gòu)建了納米酶電化學(xué)傳感器檢測(cè)CEA，線性范圍為0.01pg/mL～40ng/mL，檢出限為0.0035pg/mL。

②納米酶比色傳感器。卵巢癌是女性常見癌癥，由于早期癥狀不明顯導(dǎo)致其死亡率較高、預(yù)后較差。血清人附睪蛋白4（HE4）是卵巢癌的重要標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)其靈敏、特異檢測(cè)至關(guān)重要。Zhang等[4]制備了類POD活性的二硫化鉬納米片（MoS2NSs），可與單鏈DNA特異性結(jié)合。通過2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）和H2O2構(gòu)建反應(yīng)體系，在玻碳電極上修飾DNA3作為免疫傳感平臺(tái)，引入DNA1-Ab1、DNA2-Ab2（DNA1、DNA2、DNA3均有特異性結(jié)合部位），當(dāng)反應(yīng)體系存在HE4時(shí)會(huì)與DNA1-Ab1、DNA2-Ab2特異性結(jié)合形成三明治結(jié)構(gòu)。基于MoS2NSs和單鏈DNA特異性結(jié)合，開發(fā)了一種納米酶比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了HE4的可視化檢測(cè)，線性范圍為10-6～10ng/mL，檢出限為3×10-7ng/mL。

(2)小分子物質(zhì)的檢測(cè)

①納米酶電化學(xué)傳感器。尿酸在人體內(nèi)廣泛存在，是監(jiān)測(cè)人體健康的重要指標(biāo)。Hu等將鈷單原子錨定在富氮的石墨烯材料上合成了單原子催化劑，用于組裝納米酶電化學(xué)仿生傳感器檢測(cè)尿酸，線性范圍為0.4～41.95μM，檢出限為33.3±0.024nM。Ren等[5]提出了金屬有機(jī)框架（MOFs）的結(jié)構(gòu)缺陷作為納米酶催化效率的調(diào)節(jié)策略，在含鈷沸石咪唑骨架中摻雜半胱氨酸（Cys），使材料的比表面積和暴露活性位點(diǎn)增加，類OXD催化活性增強(qiáng)，基于此組裝納米酶電化學(xué)傳感器可以用于尿酸的靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)，線性范圍為200nM～50μM，檢出限為67nM。

②納米酶熒光傳感器。Huang等[6]制備了一種基于多酚氧化酶活性的熒光納米復(fù)合物（Pdots@AMP-Cu），可催化底物在668nm處發(fā)射紅色熒光。AMP-Cu將多巴胺氧化后，導(dǎo)致Pdots@AMP-Cu的熒光淬滅，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)多巴胺檢測(cè)，線性范圍為10～400μM，檢出限為4μM。Jing等[7]合成了類POD活性的熒光鐵基金屬有機(jī)框架復(fù)合材料（GOx@NH2-MIL-101），反應(yīng)體系存在葡萄糖時(shí)，GOx@NH2-MIL-101在456nm處的熒光被淬滅，而在565nm處的熒光信號(hào)增強(qiáng)，基于此構(gòu)建納米酶比率熒光傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的靈敏、準(zhǔn)確、特異熒光檢測(cè)，線性范圍為0.1～600μM，檢出限為0.0428μM。

③納米酶比色傳感器。Xu等發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素可加速Au-Pd氣凝膠膠化，增強(qiáng)Au-Pd氣凝膠的葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶活性。當(dāng)存在葡萄糖時(shí)，Au-Pd氣凝膠可催化葡萄糖反應(yīng)生成H2O2，隨后氧化H2O2釋放出·OH，將無色的TMB氧化為藍(lán)色，通過比色法實(shí)現(xiàn)葡萄糖的可視化檢測(cè)，線性范圍為30～250μM，檢出限為10μM。Doan[8]等通過皂莢（GA）果實(shí)提取物制備了一種簡(jiǎn)單、環(huán)保、低成本且具有類POD活性的AgNPs，基于GA-AgNP與H2O2聯(lián)合氧化TMB建立了納米酶比色傳感器檢測(cè)H2O2，線性范圍為1～8mM，檢出限為0.34mM。

(3)重金屬離子的檢測(cè)

①納米酶熒光傳感器。Cu2+是人體內(nèi)重要的離子之一，當(dāng)人體內(nèi)Cu2+過多時(shí)，會(huì)危害人體健康。Song等將磷化鐵嵌入碳基體組成有類OXD活性的二維納米片（FeP@C），對(duì)熒光底物表現(xiàn)出較強(qiáng)類OXD活性。Cys可與自由基結(jié)合淬滅熒光，基于Cu2+與Cys強(qiáng)親和力開發(fā)了一種新型納米酶熒光傳感器檢測(cè)Cu2+，線性范圍為0.04～10mM，檢出限為0.026mM。Liu等[9]制備了類POD活性的羊毛球狀硫化銅（WBLCS），在極低的熒光底物濃度下，Ag+的加入可以顯著提高級(jí)聯(lián)體系的性能，故在此基礎(chǔ)上利用WBLCS建立納米酶熒光傳感器檢測(cè)Ag+，線性范圍為0.05～75μM，檢出限5nM。

②納米酶比色傳感器。Liu等將組氨酸（His）修飾到金納米團(tuán)簇上，His通過氨基上的N原子和羧酸基上的O原子與Cu2+配位，與Cu2+表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力，快速高效捕獲Cu2+，基于此構(gòu)建了納米酶比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了Cu2+的準(zhǔn)確、特異檢測(cè)，線性范圍為1～100nM，檢出限為0.1nM。Mao等[10]開發(fā)了一種基于單原子納米酶的比色傳感技術(shù)，將單原子鐵錨定在氮摻雜的石墨烯上形成Fe-N-C結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了單原子鐵納米酶的類POD活性，以TMB作為比色探針，8-羥基喹啉（8-HQ）作為TMB氧化的抑制劑，利用Cr6+和8-HQ的相互作用實(shí)現(xiàn)Cr6+的檢測(cè)，線性范圍為30nM～3μM，檢出限為3nM。

(4)細(xì)菌的檢測(cè)

①納米酶電化學(xué)傳感器。Das等發(fā)現(xiàn)AuNPs與銅綠假單胞菌適體（F23）特異性結(jié)合會(huì)抑制其類POD活性。當(dāng)銅綠假單胞菌存在時(shí)，由于F23與銅綠假單胞菌的親和力大于AuNPs，F(xiàn)23離開AuNPs表面，使AuNPs的類POD活性恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)銅綠假單胞菌的特異性檢測(cè)，線性范圍為60.0～6.0×107CFU/mL，檢出限為60.0CFU/mL。Savas等[11]利用羧基化的GQDs與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物阻礙了GQDs的類POD活性，電化學(xué)信號(hào)降低，實(shí)現(xiàn)了牛奶和血清中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的高效檢測(cè)，檢出限分別為5CFU/mL和30CFU/mL。

②納米酶比色傳感器。大腸桿菌O157:H7是一種腸道致病菌，可引起出血性結(jié)腸炎、血栓性血小板減少紫癜等疾病。Lu等[12]利用T20控制合成了啞鈴樣Au-Pt雙金屬納米酶，通過將適配體連接的磁性納米顆粒作為分離抗體，可以有效檢出大腸桿菌O157:H7，檢出限為2CFU/mL。此外，金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可通過納米酶比色傳感器實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)。Zhang等制備了AuNPs功能化的Fe3O4NPs作為納米酶。在TMB-H2O2傳感平臺(tái)中，金黃色葡萄球菌通過Au-S鍵屏蔽Fe3O4NPs的催化活性位點(diǎn)，降低紫外可見吸收信號(hào)，實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的特異檢測(cè)，線性范圍為10～106CFU/mL，檢出限為10CFU/mL。

(5)其他蛋白質(zhì)的檢測(cè)

①納米酶熒光傳感器。酸性磷酸酶（ACP）廣泛存在于人體內(nèi)，常作為多種疾病的檢測(cè)指標(biāo)。Li等[5]基于MOFs材料制備了NH2-MIL-101作為熒光探針和仿生催化劑，在456nm（F456）處發(fā)射固有熒光，同時(shí)其本身的類POD活性能夠催化鄰苯二胺（OPD）在556nm（F556）處產(chǎn)生熒光，焦磷酸鹽離子（PPi）和NH2-MIL-101的Fe基結(jié)合，導(dǎo)致熒光淬滅，引入ACP后，由于ACP水解PPi使NH2-MIL-101恢復(fù)催化活性，基于熒光信號(hào)比值（F556/F456）的變化構(gòu)建納米酶熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)了ACP的定量檢測(cè)，線性范圍為0.01～30U/L，檢出限為0.005U/L。

②納米酶比色傳感器。C反應(yīng)蛋白（CRP）水平異常與高血壓、心血管疾病以及細(xì)菌和病毒感染等密切相關(guān)，因此CRP檢測(cè)是診斷這些疾病的重要輔助指標(biāo)。Gupta等[9]采用一鍋濕化學(xué)法原位合成檸檬酸功能化的納米粒子（CA@PtRu ANPs），在該免疫測(cè)定中，CA@PtRu ANPs充當(dāng)類POD，胺功能化的二氧化硅涂層磁性微珠（APTES/SiO2@Fe3O4）作為識(shí)別CRP的捕獲探針，當(dāng)樣本中出現(xiàn)CRP時(shí)，形成檢測(cè)抗體-CRP-捕獲抗體的免疫復(fù)合物，將無色的TMB氧化為藍(lán)色。在選擇性檢測(cè)CRP過程中線性范圍為0.01～180μg/mL，檢出限為0.01μg/mL。

3.總結(jié)與展望

納米酶?jìng)鞲衅饕呀?jīng)廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、細(xì)菌檢測(cè)等領(lǐng)域。但是目前納米酶?jìng)鞲衅髟趯?shí)際應(yīng)用中仍存在不足，在以下幾個(gè)方面仍需發(fā)展和完善：①目前發(fā)現(xiàn)的納米酶材料多具有氧化還原活性，探究如何開發(fā)新的納米酶活性種類實(shí)現(xiàn)更多物質(zhì)的特異性檢測(cè)仍有很大的發(fā)展空間；②由于納米材料的晶化結(jié)構(gòu)和表面構(gòu)型多樣性，納米酶通常表現(xiàn)出低活性和低穩(wěn)定性，需進(jìn)一步尋求新的技術(shù)實(shí)現(xiàn)納米酶的高穩(wěn)定性；③盡管納米酶?jìng)鞲衅饕褢?yīng)用于多種領(lǐng)域，但在人體基因檢測(cè)方面尚未廣泛開展，仍需努力開發(fā)此類傳感技術(shù)。