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    IgG1類抗IgE Fc單克隆抗體抑制人肥大細(xì)胞脫顆粒作用研究

    2022-11-26 04:46:11周翔魚曹羿堃儲(chǔ)晨晨張秋麗
    寧夏醫(yī)學(xué)雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:雜交瘤肥大細(xì)胞單克隆

    周翔魚,曹羿堃,李 娜,儲(chǔ)晨晨,華 冰,王 佳,張秋麗

    變態(tài)反應(yīng)是由IgE介導(dǎo)的I型速發(fā)型超敏反應(yīng),肥大細(xì)胞作為變態(tài)反應(yīng)速發(fā)相應(yīng)答的優(yōu)先靶細(xì)胞, IgE 與其高親和力受體 FcεRI結(jié)合,使機(jī)體處于致敏狀態(tài)[1-2]。類胰蛋白酶(TPS)和組胺(HIS)的釋放量可作為肥大細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志物[3]。此外,介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞存在抑制性Fc受體-CD32b(FcγR2b),由胞內(nèi)免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIMs)介導(dǎo)發(fā)揮重要的免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用[4]。本研究以人LAD2肥大細(xì)胞為靶細(xì)胞,采用雜交瘤技術(shù)制備IgG1型大鼠抗人 IgE-Fc單克隆抗體(anti-IgE-Fc mAb),探究一種新型抑制肥大細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)的體液免疫策略。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料:2020年2月于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買10只8~10周SPF級(jí)雌性SD大鼠,體重(180±1.58)g,自由攝食飲水。

    1.2 試劑:Y3 Ag1.2.3骨髓瘤細(xì)胞和人LAD2 肥大細(xì)胞,均購(gòu)自深圳豪地華拓生物科技有限公司。人IgE Fc蛋白(hum-IgE Fc)由空軍軍醫(yī)大學(xué)祝道成教授惠贈(zèng)。

    1.3 方法

    1.3.1 抗IgE-Fc單克隆抗體制備:將100 μg hum-IgE Fc蛋白每間隔2周免疫SD大鼠,共致敏4次后取脾臟組織,制備脾細(xì)胞懸液與Y3 Ag1.2.3骨髓瘤細(xì)胞以5∶1混合,在50% PEG4000作用下,經(jīng)HAT和HT培養(yǎng)基中篩選融合雜交瘤細(xì)胞。有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)hum-IgE Fc、OVA和β-內(nèi)酰胺酶包被ELISA板鑒定anti-IgE-Fc mAb特異性。收集上清,ELISA試劑盒測(cè)定IgG1和IgM濃度。

    1.3.2 LAD2細(xì)胞脫顆粒變化:實(shí)驗(yàn)分組為Compound 48/80組(Comp 48/80)、Comp 48/80+hum-IgE Fc、Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb和Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb,分別體外培養(yǎng)48 h,0.05 μm Comp 48/80刺激各組45 min,陰性對(duì)照(Control)不做任何處理。甲苯胺藍(lán)染色觀察各組LAD2細(xì)胞脫顆?,F(xiàn)象并收集上清液,ELISA試劑盒測(cè)定HIS和TPS濃度變化。

    1.3.3 TPS和CD32b蛋白表達(dá)變化:采用Western blot法檢測(cè),即取各組細(xì)胞在裂解蛋白酶作用下提取總蛋白,通過BCA試劑盒對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè);上樣電泳后220 V恒壓轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入Rabbit-anti-TPS(1∶500)、Rabbit-anti-CD32b(1∶1 000)和mouse-β-actin(1∶1 000),4 ℃孵育過夜;HRP標(biāo)記二抗(1∶20 000),室溫孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光液,曝光,Image J軟件分析蛋白條帶。

    2 結(jié)果

    2.1 anti-IgE-Fc mAb制備及亞類鑒定:經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后呈團(tuán)狀生長(zhǎng),細(xì)胞間雜交成功。采用有限稀釋篩選出分泌anti-IgE-Fc mAb 的特異性雜交瘤株2F4和6D12;ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,IgG1表達(dá)上調(diào)(P<0.05),IgM差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),即抗原特異性雜交瘤細(xì)胞分泌anti-IgE Fc單克隆抗體亞類為IgG1型。

    2.2 LAD2 細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比,各組LAD2 肥大細(xì)胞均釋放大量酸性顆粒呈紫紅色,脫顆粒程度增加,HIS和TPS釋放濃度均顯著增加(P<0.05)。與Comp 48/80組比較,Comp 48/80+hum-IgE Fc組和Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb組脫顆粒程度無明顯變化,HIS和TPS釋放差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb組釋放酸性顆粒減少,HIS和TPS釋放濃度明顯降低(P<0.05),見表1,圖1(封三)

    2.3 LAD2細(xì)胞TPS和CD32b蛋白表達(dá)變化:Western blot 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Comp 48/80組、Comp 48/80+hum-IgE-Fc和Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb組TPS蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05),CD32b表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb組與Comp 48/80組、Comp 48/80+hum-IgE-Fc組相比TPS表達(dá)下調(diào),CD32b表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)果提示,anti-IgE-Fc mAb在游離的IgE-Fc存在時(shí)可抑制人肥大細(xì)胞脫顆粒,這種作用可能是由CD32b介導(dǎo)。

    3 討論

    臨床治療變態(tài)反應(yīng)疾病的各種IgG型單克隆抗體受到越來越多的關(guān)注,其中的作用機(jī)制亟待闡明。本研究通過構(gòu)建重組人IgE Fc蛋白制備動(dòng)物源性單克隆IgG1類抗體,經(jīng)過人源化轉(zhuǎn)換并進(jìn)行鑒定分離純化,篩選2株特異性IgG1型抗IgE Fc單克隆抗體的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞株。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Compound 48/80為肥大細(xì)胞非特異性激活劑,誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞劇烈的脫顆粒反應(yīng)(P<0.05)。Compound 48/80和hum-IgE Fc共同刺激肥大細(xì)胞后,肥大細(xì)胞酸性顆粒含量變化較單獨(dú)Compound 48/80作用不明顯,培養(yǎng)液上清液中HIS和TPS釋放濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且LAD2肥大細(xì)胞TPS及CD32b分子表達(dá)均無明顯變化(P>0.05)。由于hum-IgE- Fc蛋白不存在抗體Fab段的抗原互補(bǔ)決定區(qū),不能有效識(shí)別結(jié)合特異性抗原,F(xiàn)c結(jié)合FcεRI后不發(fā)生受體變構(gòu)和交聯(lián),無法啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞活化脫顆粒[5-6],與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。采用Compound 48/80與anti-IgE-Fc mAb聯(lián)合作用于LAD2肥大細(xì)胞,顆粒含量變化較單獨(dú)Compound 48/80作用不明顯,培養(yǎng)液上清中HIS和TPS釋放濃度,TPS及CD32b分子表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。研究表明,IgG1類anti-IgE-Fc mAb的Fab抗原結(jié)合區(qū)可競(jìng)爭(zhēng)性與人IgE- Fc段抗原結(jié)合,肥大細(xì)胞上是否存在已裝配的IgE分子,由于IgG1類抗體的Fc段不能與FcεRI相互作用[7]。因此,單獨(dú)刺激LAD2細(xì)胞時(shí)無脫顆粒效應(yīng)。采用制備的anti-IgE-Fc mAb聯(lián)合Compound 48/80和hum-IgE- Fc致敏LAD2肥大細(xì)胞,酸性顆粒釋放卻明顯減少,上清液中HIS和TPS釋放濃度降低,TPS蛋白下調(diào),CD32b表達(dá)卻增加(P<0.05)。有研究發(fā)現(xiàn),肥大細(xì)胞表面表達(dá)CD64、CD32b等IgG1受體,IgG1-Fc與CD64結(jié)合時(shí)產(chǎn)生靶細(xì)胞活化效應(yīng),但無關(guān)肥大細(xì)胞脫顆粒信號(hào)途徑的激活[8]。IgG1是CD32b的配體之一,能夠誘導(dǎo)CD32b表達(dá)上調(diào),IgG1-Fab可以特異性地識(shí)別游離的或已結(jié)合在肥大細(xì)胞上的IgE-Fc區(qū),在IgG1-Fc區(qū)同時(shí)與CD32b結(jié)合,才可以啟動(dòng)胞內(nèi)ITIMs,引起的肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)以及胞內(nèi)顆粒組裝,進(jìn)而減輕I型超敏反應(yīng)的炎性反應(yīng)[9-10]??梢?,CD32b的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用有助于抑制I型超敏反應(yīng)的病情進(jìn)展。

    本研究結(jié)果提示,以游離的IgE-Fc作為變應(yīng)原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)特異性抗原的IgG1型體液免疫,有望成為I型超敏反應(yīng)的免疫治療策略之一。但本研究中諸多機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明,如CD32b抑制性信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白分子還沒有明確,這種抑制肥大脫顆粒作用機(jī)制究竟發(fā)生于顆粒組裝還是運(yùn)輸,或是膜融合及胞吐環(huán)節(jié)也尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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