副雞禽桿菌研究進展

劉棟輝,郭夢嬌,張 昊,譚惠惠,靳逸昆,張小榮,吳艷濤

(揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)最早于20世紀(jì)30年代被報道，之前被稱為副雞嗜血桿菌，2005年Blaclall P J將其重新命名為副雞禽桿菌[1]。感染副雞禽桿菌會引起一種雞的急性上呼吸道疾病——傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)。一般情況下該病的潛伏期較短、發(fā)病急且傳染性強，病死率低。但與其他病原如支原體、傳染性支氣管炎病毒、腺病毒等發(fā)生混合感染時，病死率會顯著升高[2-3]，給養(yǎng)殖場造成巨大經(jīng)濟損失。

1 副雞禽桿菌的病原特性

1.1 病原簡介

副雞禽桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，無鞭毛，其毒力菌株常常存在莢膜結(jié)構(gòu)。該菌為兼性厭氧菌，液體環(huán)境培養(yǎng)時無需補充CO2，但在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時需提供厭氧環(huán)境或體積分?jǐn)?shù)為3%～10%的CO2。其生長繁殖速度較慢，營養(yǎng)需求較高，在普通培養(yǎng)基上不生長，體外培養(yǎng)時一般需要添加V因子，但也存在非V因子依賴的副雞禽桿菌菌株[4]。固體培養(yǎng)基上生長24 h形成針尖大、圓形、灰白色半透明的菌落。在血瓊脂上與金黃色葡萄球菌交叉劃線培養(yǎng)，可以觀察到“衛(wèi)星現(xiàn)象”。在臨床分離細(xì)菌時需要注意，副雞禽桿菌對外界環(huán)境抵抗力不強，因此現(xiàn)場采集的病料要盡快進行細(xì)菌分離，否則可能無法分離到活菌。

1.2 分型方法

最初Page采用玻板凝集方法將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個血清型。后有研究表明，通過血凝抑制試驗(hemagglutination inhibition,HI)進行副雞禽桿菌的Page分型更為有效[5]。雖然也出現(xiàn)部分分離株無法分型的情況，但Page分型方案仍是目前應(yīng)用最廣的副雞禽桿菌血清學(xué)分型方案。Kume等進一步通過血凝抑制試驗將副雞禽桿菌分出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 共3個血清群9種血清型，并將其與Page方案對應(yīng)，劃分出A1、A2、A3、A4、B1、C1、C2、C3和C4共9個血清型，但由于其過程繁瑣、試驗條件較苛刻，所以應(yīng)用范圍較窄[6]。在對微生物的研究中，基于DNA的分子生物學(xué)分型方法更為便捷。一些研究也對副雞禽桿菌的基因分型方法進行了探索，Sakamoto R等[7]提出以副雞禽桿菌的hmtp210基因的高變區(qū)為靶標(biāo)，使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RPLP)和多重PCR(multiplex PCR,mPCR)方法來進行分型，但這兩種方法在之后的研究中被證明并不可靠，不能用來代替Page或Kume分型方案[8]。之后Tan D H等[9]通過分析副雞禽桿菌hmtp210基因序列和血清型之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，使用hmtp210基因的部分序列進行遺傳進化分析,可以用來區(qū)分A、B、C 3種血清型，該研究為開發(fā)與副雞禽桿菌血清學(xué)分型相對應(yīng)的分子分型方法提供了新方案。

1.3 鑒別診斷

在診斷傳染性鼻炎時，除了進行病原菌的分離培養(yǎng)及生化特性鑒定外，目前廣泛使用陳小玲等[10]建立的PCR鑒定方法(HPG2-PCR)進行診斷。錢琳娜等[11]開發(fā)了針對雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)、滑液囊支原體(Mycoplasmasynovium，MS)和副雞禽桿菌的三重PCR，通過測試表明,其建立的三重PCR診斷技術(shù)具有良好的特異性和較高的靈敏性，可用于臨床上對這幾種常見的雞呼吸道疾病的鑒別診斷。Clothier K等[12]在HPG2-PCR的基礎(chǔ)上，開發(fā)實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)方法用于樣品的快速檢測，該方法靈敏度高、特異性好，最低檢出率為10 CFU/mL。梅晨等[13]原核表達了副雞禽桿菌的血凝素蛋白HMTP210中保守的P9片段，并以該蛋白為抗原開發(fā)了一種間接ELISA檢測方法，該方法可以檢測出3個血清型的副雞禽桿菌的陽性雞血清，并且在測試中與其他禽病的病原體抗血清無交叉反應(yīng)。

1.4 毒力因子

1.4.1 血凝素蛋白 血凝素蛋白是副雞禽桿菌重要的一種免疫保護性抗原，相應(yīng)的血凝抑制抗體水平也被作為評價傳染性鼻炎疫苗免疫保護效果的重要指標(biāo)。有研究認(rèn)為外膜蛋白HagA是副雞禽桿菌的血凝素蛋白[14]。但進一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然重組HagA蛋白表現(xiàn)出血凝活性，但并不存在血清特異性，不同血清型菌株間的HagA蛋白編碼基因同源性在95%以上。使用相應(yīng)的單克隆抗體或全菌多克隆抗體也不能使該蛋白出現(xiàn)血凝抑制，且對致病菌株的免疫保護效果中等[15]。因此認(rèn)為HagA蛋白可能只是一種副雞禽桿菌的普遍抗原，并不是主要誘導(dǎo)產(chǎn)生血凝素抑制抗體的血凝素蛋白，而其表現(xiàn)出的血凝性可能是由于該蛋白具有與細(xì)菌黏附定植有關(guān)的功能而與紅細(xì)胞產(chǎn)生的交叉反應(yīng)。而HMTP210蛋白已被證實是副雞禽桿菌的血凝素蛋白，該蛋白是與細(xì)菌的生物被膜形成和黏附宿主細(xì)胞有關(guān)的一種黏附素，主要以三聚體形式存在。缺失了hmtp210基因的副雞禽桿菌菌株失去了血凝活性且不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生血凝抑制抗體[16]。不同血清型的HMTP210中間部位存在一段高變區(qū)，而上、下游序列高度同源，這提示該蛋白的高變區(qū)可能與菌株的血清特異性相關(guān)。

1.4.2 內(nèi)源性質(zhì)粒 質(zhì)粒是獨立于細(xì)菌基因組之外的攜帶遺傳信息的環(huán)狀DNA分子，可以攜帶耐藥基因或其他功能元件，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等，是影響細(xì)菌毒力的重要因素。2007年，Hsu Y M等[17]從副雞禽桿菌分離株中鑒定了一種耐藥性相關(guān)質(zhì)粒pYMH5。該質(zhì)粒攜帶sulⅡ、strA、mbeCy、aphAⅠ4個耐藥基因。質(zhì)粒上還可能攜帶著某些特殊基因，對菌株的生長特性或者毒力產(chǎn)生影響。Terry T D等[18]在當(dāng)?shù)胤蛛x株中發(fā)現(xiàn)一種大小為6.29 kb質(zhì)粒p250。該質(zhì)粒上有一個細(xì)菌素產(chǎn)生位點，且與流感嗜血桿菌的相關(guān)基因高度同源。Hsu Y M等[17]還檢測到另一種質(zhì)粒pA14，該質(zhì)?？梢跃幋aMglA蛋白和RNase Ⅱ，推測與副雞禽桿菌的毒力有關(guān)。

1.4.3 其他毒力因子 隨著研究的深入，副雞禽桿菌的其他毒力因子被不斷鑒定和分析，如莢膜、菌毛蛋白、脂多糖、RTX(repeats-in-toxins)毒素等。副雞禽桿菌強毒株均具有莢膜，但在傳代過程中會失去莢膜形成能力，從而導(dǎo)致菌株毒力降低，不能引起傳染性鼻炎特征性癥狀。Liu C C等[19]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lfA重組蛋白作為傳染性鼻炎的亞單位疫苗對相應(yīng)野生型菌株有一定的保護作用，研究中構(gòu)建的菌毛蛋白編碼基因flfA缺失株的毒力也顯著低于野生型。Küng E等[20]報道了一種在副雞禽桿菌中常見的RTX毒素AvxA，該種毒素蛋白會導(dǎo)致宿主細(xì)胞和組織發(fā)生損傷，并破壞機體的防御功能[21]，該毒素可能與副雞禽桿菌定植呼吸道后引起的機體損傷有關(guān)。

2 流行情況

傳染性鼻炎一年四季都可發(fā)生，季節(jié)更替時多發(fā)。以育成雞和產(chǎn)蛋雞發(fā)病較多，此外還有關(guān)于野雞和鵪鶉等感染發(fā)病的報道。該病目前在中國、美國、墨西哥以及南非等世界各地均有報道[22-23]，近年來，我國多個地區(qū)的發(fā)病率也呈上升趨勢。龔玉梅等[24]的報道顯示，在2012年-2017年6年間從我國各地送檢病料中分離的45株副雞禽桿菌中，主要流行的副雞禽桿菌為B血清型，有30株分離株；其次為A血清型，有15株分離株；未檢測到C血清型。冀笑明等[25]在2018年-2019年對山東、河南、河北及江蘇等地的發(fā)病雞群進行細(xì)菌分離鑒定中，共分離得到87株副雞禽桿菌。其中包括血清A型20株、血清B型57株、血清C型10株，這表明副雞禽桿菌在我國的暴發(fā)和流行愈發(fā)嚴(yán)重，且A、B、C 3種血清型的副雞禽桿菌在我國均有流行，B血清型與之前的流行情況類似，依然是國內(nèi)主要流行株。趙怡等[26]的調(diào)查結(jié)果顯示，2019年在其從各地分離到副雞禽桿菌的15組病料中，10組為A型菌感染，5組為C型。綜合來看，目前我國副雞禽桿菌流行態(tài)勢較之前有了一些變化，雖然我國目前仍然是3種血清型均有流行，但之前一直占主導(dǎo)地位的B血清型的發(fā)病率有所下降，而C血清型的發(fā)病率則在逐漸升高。

3 副雞禽桿菌病的防控方法

3.1 藥物治療

當(dāng)養(yǎng)殖場暴發(fā)傳染性鼻炎時，可使用抗菌藥物進行治療。針對傳染性鼻炎治療效果較好的有磺胺類、四環(huán)素類以及鏈霉素等氨基糖苷類藥物，但是目前病菌對抗菌藥物的耐藥性目前比較常見。因此在臨床治療時，需要對分離株進行藥物敏感性試驗，從而確定最佳用藥方案。此外，需要注意藥物的用法用量及給藥時間：產(chǎn)蛋期不可使用磺胺類藥物[27]?？蛇m當(dāng)延長藥物治療時間，以防傳染性鼻炎未被完全治愈，反復(fù)發(fā)作；同時為了避免病菌在治療過程中短時間內(nèi)產(chǎn)生耐藥性，可進行穿梭用藥、輪換用藥等。

3.2 疫苗研究

3.2.1 滅活苗 疫苗防控是目前防控傳染性鼻炎的一種重要手段，常用的有二價苗和三價苗[28-29]。由于不同血清型之間交叉保護效果較差，并且我國3種血清型均流行，因此目前多應(yīng)用A、B、C 3個血清型的三價滅活疫苗進行免疫[30]。如Gong等研制出副雞禽桿菌的油乳劑三價滅活疫苗，在兩次免疫后9個月，對 A、B、C 3型副雞禽桿菌攻毒的保護率仍然不低于80%[31]。此外，也可聯(lián)合其他病原體制備多聯(lián)苗，如副雞禽桿菌二價或三價和雞毒支原體的二聯(lián)油乳劑滅活苗等。但副雞禽桿菌全菌滅活疫苗一方面培養(yǎng)成本較高，另一方面革蘭氏陰性菌中脂多糖、莢膜等菌體蛋白會引起機體副作用，加上滅活苗注射量較大，會進一步加重疫苗的副作用[32]。

3.2.2 基因工程疫苗 基因工程疫苗的開發(fā)需要探究病原體的免疫保護抗原和毒力因子等，目前研究的主要有弱毒苗和亞單位疫苗。如Wang Y P等[16]構(gòu)建了hmtp210基因缺失株，并驗證缺失株的毒力相比于野生型明顯降低。Tu T Y等[33]構(gòu)建了副雞禽桿菌莢膜形成相關(guān)基因hctA基因缺失株，并驗證缺失株的毒力較野生型減弱。這些基因缺失株將來可以作為傳染性鼻炎的弱毒苗候選株。亞單位疫苗也是副雞禽桿菌基因工程疫苗研究的重點，Noro T等[34]表達的重組血凝素蛋白對同源菌株可產(chǎn)生100%的保護率。Sakamoto R等[35]將A型和C型副雞禽桿菌的HMTP210的高變區(qū)進行融合表達，用該融合肽制備的疫苗接種35日齡SPF雞。攻毒結(jié)果顯示免疫雞不表現(xiàn)臨床癥狀，且接種部位無腫脹等不良反應(yīng)。趙成全等[36]根據(jù)副雞禽桿菌外膜蛋白GcbG研制的亞單位疫苗的保護率優(yōu)于全菌滅活疫苗，可達90%。Mei C等[37]發(fā)現(xiàn)副雞禽桿菌的外膜囊泡可為同種血清型提供較好的保護性，但對不同血清型交叉保護性較弱。這提示外膜囊泡可作為一種潛在的新型替代疫苗。

4 小結(jié)

副雞禽桿菌感染雞會引起傳染性鼻炎，對雞的生產(chǎn)性能會造成較大影響，如引起育成雞生長不良、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降等，若與其他病原如支原體、傳染性支氣管炎病毒等混合感染會造成更大的損失。近年來傳染性鼻炎發(fā)病率呈逐年上升趨勢，提高飼養(yǎng)管理水平、做好生物安全措施，再加上合理的疫苗接種是目前應(yīng)對傳染性鼻炎較為有效的防控手段，但仍需進一步探究副雞禽桿菌的致病機制以及新型防控措施。