噬菌體在畜牧養(yǎng)殖及肉制品加工中的應(yīng)用

孫新城，許素月，李俠穎，趙成鑫,，胡旭陽，胡金強(qiáng)高 輝,2,3，楊德良，白艷紅,2,3*，張曉根

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450001；4.長安大學(xué)經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院，陜西西安710064)

隨著人們生活水平的提高，對于動(dòng)物蛋白的需求量也越來越大，使得畜牧行業(yè)開始向產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模轉(zhuǎn)型，發(fā)展過程中細(xì)菌性疾病的防治成了必須要解決的問題[1]?？咕幬锸腔瘜W(xué)合成的一種抗菌類藥物，在畜牧生產(chǎn)過程中對于細(xì)菌性疾病具有較好的預(yù)防和治療效果。然而抗菌藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)性且大批量的使用也逐漸的產(chǎn)生了很多問題，例如細(xì)菌的耐藥性、腸道菌群破壞和抗菌藥物殘留等問題，對養(yǎng)殖行業(yè)造成一定損失的同時(shí)，也嚴(yán)重威脅了人類的身體健康[2]。由于逐年累積的使用抗菌藥物，部分細(xì)菌產(chǎn)生了變異，原來的抗菌藥物不能再繼續(xù)發(fā)揮抑制細(xì)菌的作用，養(yǎng)殖業(yè)在面對新的變異細(xì)菌時(shí)不得不承受嚴(yán)重?fù)p失[3]。在動(dòng)物生長的過程中如果添加抗菌藥物實(shí)現(xiàn)抗病力提高或促進(jìn)發(fā)育等目的，會(huì)極大的擾亂動(dòng)物本身的免疫調(diào)節(jié)能力，停止抗菌藥物的使用會(huì)對動(dòng)物的生長造成嚴(yán)重影響，并且對于后代繁衍以及養(yǎng)殖環(huán)境中的菌群平衡都有一定的影響[4]。通常情況下抗菌藥物在動(dòng)物體內(nèi)需要一定的時(shí)間才能夠完全代謝，如果時(shí)間不夠會(huì)使得抗菌藥物在肉類等農(nóng)產(chǎn)品中殘留，最終人類在食用之后對身體健康也會(huì)產(chǎn)生影響，抗菌藥物殘留是人們關(guān)注的食品安全健康問題之一。

在抗菌藥物濫用問題的背景下，噬菌體作為一種特異且安全的抑菌劑開始被研發(fā)人員所關(guān)注。噬菌體自身的基因組較小，但是在宿主菌中卻能產(chǎn)生較大的影響[5]。較小的基因組會(huì)使得研究應(yīng)用的時(shí)間大大縮短，操作過程更加簡易，研發(fā)成本也會(huì)相應(yīng)降低。噬菌體本身來自于自然界，只是對特定的菌群產(chǎn)生反應(yīng)，對原本的生態(tài)菌群不會(huì)產(chǎn)生不利影響，是一種環(huán)境友好型的生物抗菌劑，十分迎合當(dāng)代人提倡的綠色無公害要求。另外，噬菌體會(huì)隨著細(xì)菌的突變自身也發(fā)生進(jìn)化，是一個(gè)自發(fā)且符合生態(tài)環(huán)境要求的過程，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性等問題[6]。噬菌體超強(qiáng)的特異性肯定了其安全性，不會(huì)在肉、蛋、奶等畜牧產(chǎn)品中殘留，即使人體食用，對腸道內(nèi)原本的益生菌也無侵染效果，所以噬菌體在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)中應(yīng)用具有較大價(jià)值。

1 噬菌體概述

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對噬菌體的認(rèn)識(shí)越來越深入，有人把能夠侵襲真菌、藻類、細(xì)菌以及放線菌等微生物的病毒都稱為噬菌體。噬菌體廣泛存在于自然界的各種環(huán)境中，幾乎有細(xì)菌群落的地方就有噬菌體的存在，有數(shù)據(jù)估計(jì)地球上有1031個(gè)噬菌體[7]。噬菌體種類多種多樣，并且特異性極高，對于某一種或一類微生物有效，但是對于非目標(biāo)靶向的其他細(xì)菌或者人類是無毒且具有極高的安全性。噬菌體的分類方法也是多種多樣的，根據(jù)噬菌體侵染宿主時(shí)的表現(xiàn)分為偽溶原性、溶原性、裂解性和慢性感染4種類型[8]。噬菌體的核酸主要有DNA和RNA兩種，根據(jù)核酸的類型又可以分為單鏈RNA(ssRNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈RNA(dsRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)4種類型。另外，國際病毒命名委員會(huì)(ICNV)對噬菌體進(jìn)行了更加細(xì)致的分類，在15個(gè)科中大多數(shù)都是有尾噬菌體，根據(jù)尾部的結(jié)構(gòu)更深一步進(jìn)行了區(qū)分，其中短尾噬菌體占14%，長尾噬菌體科占61%，肌尾噬菌體科占25%[9]。噬菌體的種類多種多樣并且長度變化很大，目前發(fā)現(xiàn)的最短噬菌體24 nm，最長的噬菌體200 nm，T4噬菌體是目前已知的最大的噬菌體。噬菌體的組成較為簡單，幾乎都是由蛋白質(zhì)外殼和遺傳物質(zhì)核酸組成[10]。噬菌體的增殖包括吸附、侵入、生物合成、裝配和釋放五個(gè)階段，整個(gè)過程完全依賴宿主提供必需的物質(zhì)[11]。吸附是噬菌體侵染宿主的第一步，主要依靠蛋白外殼與宿主細(xì)胞外部蛋白特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，一旦特異性蛋白損壞宿主菌就具有了抵抗噬菌體的能力。侵入是通過噬菌體尾部釋放特定的溶菌酶將宿主菌的外膜破壞，然后噬菌體將遺傳物質(zhì)核酸注入到宿主菌的過程。生物合成是進(jìn)入到宿主菌的核酸通過宿主體內(nèi)的各種物質(zhì)合成自身的mRNA，然后進(jìn)一步合成早期的蛋白質(zhì)[12]。等噬菌體的各部件合成后就會(huì)進(jìn)行下一步裝配，將各種蛋白質(zhì)按照一定程序組裝在一起，大體分為4個(gè)階段：頭部裝配、尾部裝配、頭部與尾部裝配、長尾絲裝配[13]。最終組裝好的噬菌體通過釋放內(nèi)溶素等物質(zhì)將宿主菌的細(xì)胞膜裂解，從而將子代噬菌體釋放出來。

2 噬菌體在畜禽幼齡期的應(yīng)用

幼齡培育是養(yǎng)殖行業(yè)中的重要環(huán)節(jié)，然而環(huán)境中的感染性細(xì)菌無處不在，主要的細(xì)菌為大腸埃希氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。一旦感染了細(xì)菌性疾病很容易造成幼齡期的動(dòng)物大量死亡，對養(yǎng)殖場造成較大損失。目前，研發(fā)人員已經(jīng)分別從養(yǎng)殖過程的各種環(huán)境中分離出多種多樣的噬菌體，采用不同的防治方法去對抗細(xì)菌性疾病，且在不同動(dòng)物的應(yīng)用過程中取得了較好的效果。

雛雞由于本身免疫系統(tǒng)不夠完全很容易被感染，感染后容易造成生長遲緩，嚴(yán)重的會(huì)引起大量死亡，研發(fā)人員嘗試使用單一噬菌體或者混合噬菌體的方式對其進(jìn)行防治。劉功成[14]曾在1日齡的三黃雞日糧中添加了噬菌體，結(jié)果表明單一噬菌體能夠有效提升雛雞的成活率。Kim J H等[15]也是從1日齡的肉仔雞開始投喂含有混合噬菌體的飼料，飼養(yǎng)35 d后發(fā)現(xiàn)投喂了混合噬菌體的肉仔雞發(fā)育更好，并且有效抑制了致病菌的感染。曹忠贊等[16]使用噬菌體制劑對感染了沙門氏菌的雛雞進(jìn)行治療，結(jié)果表明在雛雞的肝和盲腸中致病菌的數(shù)量顯著減少，最終雛雞的肝和盲腸都恢復(fù)到了正常水平，由此可知在防治雛雞感染沙門氏菌時(shí)噬菌體有良好的抑菌效果。Kaikabo A A等[17]也曾采用殼聚糖包被噬菌體的方式對幼齡雞進(jìn)行治療，使得幼雞的死亡率降低了40%，并且發(fā)現(xiàn)殼聚糖包被使用噬菌體的方法能夠有效提升噬菌體在幼雞體內(nèi)的存活率。

在仔豬培育的初期，如果受到致病細(xì)菌的感染，會(huì)導(dǎo)致腹瀉、生長受阻以及成活率降低等眾多不良現(xiàn)象，目前研究者已經(jīng)試驗(yàn)了多種噬菌體療法，并取得了較好成果。曾永娣等[18]曾經(jīng)嘗試給斷奶的仔豬飼料中添加噬菌體，并使用添加抗菌藥物的飼料作為對照，最后發(fā)現(xiàn)飼料中添加噬菌體的仔豬增重更多，并且腹瀉率大大降低，相比于添加抗菌藥物，噬菌體能夠有效提升仔豬腸道中益生菌的活性。Seo B J等[19]的研究表明，當(dāng)給28日齡的仔豬飼料中添加噬菌體雞尾酒后，仔豬受沙門氏菌感染的風(fēng)險(xiǎn)降低，并且仔豬本身的腸道益生菌活性并未受到影響。Cha S B等[20]給斷奶的仔豬投喂含有1 g/kg噬菌體的飼料，持續(xù)投喂1周后再用腸毒性大腸埃希氏菌進(jìn)行攻擊，最終發(fā)現(xiàn)投喂噬菌體的仔豬抵抗力有效加強(qiáng)，被腸毒性大腸埃希氏菌感染的幾率下降了約60%。

3 噬菌體在畜禽成長過程中的應(yīng)用

在畜禽的成長過程中如果被致病菌感染，對于動(dòng)物的后期發(fā)育以及后期繁殖都會(huì)造成很大的影響，極大的提升了養(yǎng)殖成本。研究人員從動(dòng)物的生存環(huán)境中篩選出具有特異性治療的有益噬菌體，致力于解決各種致病菌的生物防治。

豬在生長過程被致病菌感染會(huì)對腸道菌群影響很大，對于飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)難以吸收，產(chǎn)肉率會(huì)大大降低。Yan L等[21]曾在豬的生長過程中持續(xù)飼喂了6周的噬菌體，最終檢測發(fā)現(xiàn)豬糞便中沙門氏菌的含量下降很多，并且對于飼料中的干物質(zhì)和氮源的吸收效果增強(qiáng)。另外Saez A C等[22]采用了微囊包裹噬菌體雞尾酒的方法放在飼料中對生長豬進(jìn)行投喂，并且與灌喂的方法進(jìn)行了對比，數(shù)據(jù)顯示微囊包裹的方法效果更好，噬菌體雞尾酒有效的降低了生長豬腸道中的沙門氏菌數(shù)量。

對于牛和羊等產(chǎn)奶類動(dòng)物，在養(yǎng)殖過程中極易被金黃色葡萄球菌等致病菌感染導(dǎo)致乳腺炎的發(fā)生，抗菌藥物并不能治療被生物膜包裹的致病菌，噬菌體卻能夠穿過生物膜并可以專一性的治療，是較為理想的治療方法。在奶山羊生長發(fā)育的過程中金黃色葡萄球菌會(huì)引起乳腺炎，Mishra A K等[23]曾經(jīng)分離出溶菌性噬菌體對奶山羊中的耐藥性金黃色葡萄球菌進(jìn)行了治療，結(jié)果表明在30 ℃和40 ℃時(shí)噬菌體穩(wěn)定并且裂解效果極好。冀亞路等[24]從污水中分離出一種裂解金黃色葡萄球菌的噬菌體，該噬菌體具有較強(qiáng)的殺菌能力，并且具有較寬的宿主譜(64%)，可以用于治療患有乳腺炎的奶牛。Varla-Oritz D F等[25]從患有隱形乳房炎癥的奶牛牛乳中篩選出裂解性噬菌體，數(shù)據(jù)顯示牛乳中的36株金黃色葡萄球菌種大多數(shù)都對抗菌藥物具有耐藥性，而經(jīng)噬菌體裂解后被殺死的幾率是百分百。

4 噬菌體在肉制品加工中的應(yīng)用

人們生活品質(zhì)的不斷提升，對肉、蛋、奶等食品的需求量越來越大，在大規(guī)模生產(chǎn)這些食品的同時(shí)預(yù)防食源性致病菌的問題也日益嚴(yán)重，近年來報(bào)道的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、李斯特菌等致病菌污染的事件造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對食用者的安全也存在威脅[26]。研究人員嘗試著從養(yǎng)殖過程，肉制品生產(chǎn)過程、保藏運(yùn)輸和銷售等不同時(shí)期利用噬菌體進(jìn)行生物防治，取得了較為理想的效果。

牛肉因?yàn)槠涓叩鞍椎椭镜奶攸c(diǎn)被人們廣泛食用，然而被沙門氏菌等致病菌污染的牛肉被食用后，會(huì)將感染食用人群，因此預(yù)防牛肉感染成為了必須要解決的食品安全問題。David等曾嘗試用噬菌體雞尾酒達(dá)到給牛肉滅菌的效果，結(jié)果顯示噬菌體雞尾酒的效果優(yōu)于單一噬菌體，并且在4 ℃的環(huán)境中儲(chǔ)存6 d后仍然有很好的滅菌效果[27]。聶若男等[28]篩選出一株裂解性噬菌體，將該噬菌體用于牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的防治，在4 ℃和25 ℃兩種條件下進(jìn)行了抑菌測試，在兩種溫度下牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的感染率均降低，表明篩選的噬菌體對牛肉中鼠傷寒沙門氏菌具有良好的抑菌效果。

中國作為一個(gè)肉制品消費(fèi)大國，除了牛肉外對于其他生鮮類的肉制品也是需求量巨大。在生鮮肉的抑菌防治過程中，生鮮肉與噬菌體的接觸面積對于抑菌效果的影響較大，接觸面積越小效果越理想。Sharma C S等[29]使用切碎的火雞肉和整塊的火雞肉做了對比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整塊火雞肉的噬菌體抑菌效果要明顯優(yōu)于切碎的火雞肉，分析原因是切碎后表面積增大使得細(xì)菌與噬菌體的接觸幾率降低。但是Yeh Y等的試驗(yàn)結(jié)果也證明了噬菌體對于碎肉有抑菌效果，他們將碎肉與噬菌體和致病菌混合揉滾2 h后放于4 ℃的環(huán)境中冷藏，數(shù)據(jù)表明顯著抑菌的時(shí)間可持續(xù)6 h[30]。另外，在一些即食食品中噬菌體同樣有較好的殺菌效果。Chang Y等[31]曾使用噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)溶素用于火腿樣品，數(shù)據(jù)顯示在15 min內(nèi)的抑菌效果較好。

在我國蛋制品也是餐桌上不可缺少的元素，然而如果雞、鴨、鵝等動(dòng)物在養(yǎng)殖過程被致病菌感染，很可能會(huì)對蛋的產(chǎn)量以及蛋的品質(zhì)有所影響。研究人員曾經(jīng)篩選出一株裂解能力強(qiáng)并且噬菌譜較廣的噬菌體，經(jīng)試驗(yàn)證明對于蛋黃和蛋白中感染的多重耐藥沙門氏菌具有較好的抑制效果[32]。如果鴨在養(yǎng)殖過程中受到沙門氏菌的感染，在鴨肉被感染的同時(shí)產(chǎn)出的鴨蛋也會(huì)受到污染，會(huì)給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的損失。有學(xué)者曾經(jīng)從鴨場中分離出1株噬菌譜較廣的噬菌體，試驗(yàn)表明該噬菌體在3 h可以保持較強(qiáng)的噬菌體裂解能力[33]。

5 展望

在對畜牧養(yǎng)殖行業(yè)生態(tài)環(huán)保且安全可靠的高標(biāo)準(zhǔn)要求下，噬菌體治療不產(chǎn)生耐藥性、特異性強(qiáng)、來源廣泛、綠色環(huán)保、研發(fā)容易等等優(yōu)勢會(huì)越來越顯著，相信在研究人員的共同努力下，噬菌體制劑會(huì)不斷研發(fā)用于各種致病菌的生物防治。但是噬菌體制劑研發(fā)過程也需要解決一些問題，首先用于噬菌體制劑研發(fā)的噬菌體要有較好的穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生毒素等其他不良物質(zhì)；其次噬菌體制劑使用的噬菌體最好具有較廣的噬菌譜，能夠同時(shí)抑制多種致病菌；再者噬菌體的給藥方式要不斷優(yōu)化，對于某些致病菌來說口服噬菌體的給藥方式并不是特別合適；最后噬菌體的給藥劑量也需要不斷探索。相信在科學(xué)技術(shù)飛快發(fā)展以及研究水平不斷提高的背景下，噬菌體目前面臨的問題都會(huì)被解決，在不久的將來，噬菌體能夠成為一種綠色、安全且高效的生物防治試劑，噬菌體制劑的應(yīng)用必將對畜牧養(yǎng)殖行業(yè)產(chǎn)生正向且積極的影響，對人類的健康也意義深遠(yuǎn)。