納米抗體在非洲豬瘟檢測(cè)中的應(yīng)用

王賽楠，安天賜，何 健，石建州

（南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的急性、高度接觸性、高病死率的烈性傳染病[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將非洲豬瘟列為法定通報(bào)動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病[2]。迄今為止，針對(duì)非洲豬瘟尚無有效的疫苗和藥物可以使用，它的流行和傳播會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性打擊[3]。目前對(duì)抗非洲豬瘟的主要措施是檢測(cè)和撲殺[4]。自1921年肯尼亞首次暴發(fā)ASF以來，疫情已蔓延擴(kuò)散至非洲、歐洲、美洲和亞洲地區(qū)，初步呈現(xiàn)出擴(kuò)大流行的態(tài)勢(shì)。我國自2018年8月3日在沈陽市確認(rèn)首例ASF以來[5]，疫情快速蔓延至全國各地。

納米抗體（Nanobody，Nb）是在駱駝、羊駝和鯊魚血清中發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小的新型抗體，具有低免疫原性、穩(wěn)定性高、特異性高、親和力高、組織滲透性強(qiáng)以及可識(shí)別抗原縫隙表位、易于改造、易于制備、成本低廉等特點(diǎn)，在疾病診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

1.1 非洲豬瘟概述

ASFV是一種巨大而復(fù)雜、有囊膜的DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科 （Asfarviridae）、豬瘟病毒屬（Asfivirus）的唯一成員，也是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒[6]。病毒粒子系由3萬多個(gè)蛋白亞基組裝成的直徑為260～300 nm的球狀顆粒[7]，具有與核質(zhì)大DNA 病 毒 （Nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV）超家族相同的結(jié)構(gòu)、基因組和復(fù)制特性。A SFV編碼的蛋白組裝成了五層結(jié)構(gòu)[8]，內(nèi)核芯殼（Core shell）、內(nèi)膜（Inner envelope）、核衣殼（Capsid）、外囊膜（External envelope）從內(nèi)到外依次將病毒基因組（Nueleoid）多層包裹，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)形態(tài)[9]。其蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白在內(nèi)至少有54種，尚有非結(jié)構(gòu)蛋白100多種[10]。其抗原也表現(xiàn)為多樣性[11]，參與ASFV基因組的復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、組裝以及免疫逃逸等生物過程[12]。

ASFV能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在于環(huán)境中，在豬科動(dòng)物間高效易感傳播。家豬、野豬和軟蜱為ASFV的天然宿主和傳播媒介[13]。各年齡段的豬均可感染。基于感染不同毒力的毒株，其臨床癥狀表現(xiàn)為四種類型[14]。最急性型；受強(qiáng)毒株感染，患病豬無明顯的臨床癥狀而突然死亡，死亡率達(dá)100%；急性型：受強(qiáng)毒株感染，病程為4～10 d，出現(xiàn)高熱和出血癥癥狀，病死率達(dá)100%；亞急性型：受中等毒力毒株感染，癥狀與急性型相似但較輕，病程為5～30 d，仔豬死亡率高；慢性型；受低毒力毒株感染，病程為2～15個(gè)月，患病豬出現(xiàn)波狀熱、呼吸困難、生長(zhǎng)緩慢、皮膚潰瘍以及關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。

2021年初我國出現(xiàn)了基因II型自然變異流行株，其基因組序列均發(fā)生不同程度的改變（核苷酸缺失、突變、插入或短片段替換等）[15]。 ASFV變異株毒力較為溫和，但殘存毒力傳染性很強(qiáng)。臨床表現(xiàn)不明顯，隱蔽性強(qiáng)，檢測(cè)難度大，使得疫情更加復(fù)雜難控[16]。因此，早期診斷和準(zhǔn)確快速檢測(cè)，是ASF防控體系構(gòu)建中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17]。

1.2 非洲豬瘟病毒的檢測(cè)方法

目前常用的檢測(cè)方法包括病毒分離、核酸和蛋白水平檢測(cè)。

核酸水平檢測(cè)即分子水平檢測(cè)，蛋白水平檢測(cè)即免疫學(xué)檢測(cè)。病毒分離和核酸檢測(cè)屬于抗原檢測(cè)，是檢測(cè)急性期或病程初期感染病毒以及開展?jié)摲谠\斷的有效方法。蛋白水平檢測(cè)主要是檢測(cè)抗體，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA、免疫熒光和免疫層析試紙等方法。

1.2.1 病毒分離。病毒分離是鑒定ASFV的金標(biāo)準(zhǔn)，需要在P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。首先采集臨床疑似感染豬的血液、脾臟和淋巴結(jié)等組織，分離病毒，其后接種于豬源原代細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)。ASFV在干細(xì)胞中復(fù)制增殖，出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象48～72 h后，若發(fā)生細(xì)胞病變（CPE），則說明檢測(cè)樣品中存在ASFV。若細(xì)胞分離無變化，或熒光抗體試驗(yàn)和PCR檢測(cè)呈陰性，則需再次接種，傳代3～5代，才可確認(rèn)樣品為ASFV陰性。可以說病毒分離是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[18]。病毒分離的缺點(diǎn)是操作繁瑣，鑒定周期較長(zhǎng)，需要其他輔助檢測(cè)方法參與判定。

1.2.2 核酸水平檢測(cè)方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR。基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)是最常用的ASFV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，其操作簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)，是國際貿(mào)易中OIE指定的ASFV檢測(cè)方法。PCR是替代病毒分離鑒定的一種快速、靈敏、特異的ASFV檢測(cè)技術(shù)。相比于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）有著更高的特異性與敏感性。PCR方法對(duì)病原核酸純度要求不高，適用于檢測(cè)不適合進(jìn)行病毒分離的腐敗組織或血液樣品。能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷，是非疫區(qū)檢測(cè)疫病的重要手段之一，尤其適用于鑒定體外分離不到的病原。普通PCR可用于ASF的監(jiān)測(cè)和診斷[19]。該檢測(cè)方法的缺點(diǎn)是容易發(fā)生交叉污染和依賴儀器設(shè)備。熒光定量PCR（quantitative Real-time PCR，qPCR）是將PCR與光譜進(jìn)行結(jié)合的核酸定量檢測(cè)技術(shù)，具備傳統(tǒng)PCR的特異、靈敏、快速的特點(diǎn)和光譜技術(shù)的高靈敏性和高精確定量的優(yōu)勢(shì)，高效、無需電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，自動(dòng)化程度高、閉管操作交叉污染概率低，避免了假陽性結(jié)果。qPCR包括探針法和染料法[20]。KING[21]等建立的針對(duì)ASFV-p72基因序列的qPCR，其引物和探針需經(jīng)OIE認(rèn)證。MCKLLEN[22]等建立的分子信號(hào)實(shí)時(shí)PCR靈敏度高，可鑒別診斷與ASFV癥狀相似的豬瘟。2019年初，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布了第一批ASF現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑和11種病原學(xué)檢測(cè)試劑盒，其中60%以上是采用qPCR方法，部分產(chǎn)品的敏感性和特異性達(dá)到100%。qPCR方法的顯著優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)反應(yīng)過程，測(cè)定模板的絕對(duì)量。不足之處在于容易出現(xiàn)假陽性，且對(duì)引物或探針要求高[23]。病原檢測(cè)可采用P72/CD2v/MGF或P72/EGFP/mCherry三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)病毒核酸。對(duì)不常見的基因變異且具有特殊臨床癥狀的樣品，需再進(jìn)行全基因組測(cè)序鑒別[17]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)LAMP，該技術(shù)無需高溫變性、無需溫度循環(huán)、無需電泳、無需紫外監(jiān)控，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)程短、反應(yīng)快速精確、特異性更高、結(jié)果判定直觀且成本低廉，較適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。缺點(diǎn)是容易造成氣溶膠污染，形成假陽性結(jié)果。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop mediated Isothermal Amplification，LAMP）作為一種靈敏高效、特異性強(qiáng)的基因擴(kuò)增方法，檢測(cè)不依賴于設(shè)備，能滿足基層現(xiàn)場(chǎng)的快速使用[23]，其為疫情監(jiān)測(cè)提供了一種便捷、準(zhǔn)確、低成本的選擇[25]。

1.2.3 蛋白水平檢測(cè)方法。主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和免疫層析試紙。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)作為實(shí)驗(yàn)室常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，有抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)2種，其中抗體檢測(cè)是國際貿(mào)易中OIE指定的ASF首選血清學(xué)診斷方法。其基本工作原理是通過與酶分子共價(jià)結(jié)合的抗體和吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，在底物溶液存在的情況下，由酶分子催化發(fā)生顏色反應(yīng)[26]。 采用《非洲豬瘟診斷技術(shù)》（GB/T 18648）規(guī)定的間接ELISA，阻斷ELISA等方法進(jìn)行抗體檢測(cè)[17]。ELISA具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、可使用自動(dòng)化設(shè)備檢測(cè)大量樣本、操作方便的特點(diǎn)。該方法要求操作人員具備一定的專業(yè)技術(shù)，且必須依賴儀器設(shè)備判斷試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)時(shí)程長(zhǎng)。ELISA方法可通過ASFV常用的靶標(biāo)抗原 P73、P72、P54、P32/P30 等直接檢測(cè)出感染豬抗體[27]。檢測(cè)抗原的成本低于PCR，在無特殊儀器設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室，可以實(shí)現(xiàn)在短期內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模篩查。同時(shí)，可以輔助病毒學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)[28]。ELISA主要適用于亞急性和慢性ASF的診斷。當(dāng)ELISA檢測(cè)結(jié)果不確定或者制備抗原出現(xiàn)困難時(shí)，可選用IFA血清學(xué)檢測(cè)方法復(fù)核[29]。

間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）?；诿庖邔W(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（Indirect fluorescence antibody test，IFA），系利用抗原抗體作用以定位細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的一種方法[30]。該方法的特異性好、靈敏度高、成本低，但需要具備培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)條件和熒光顯微鏡等設(shè)備。

免疫層析試紙。此為基于單克隆抗體、免疫層析、免疫標(biāo)記以及新材料等而發(fā)展出的一種簡(jiǎn)便快速的新型免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) （Immunochromatographic lateral flow strip test，ILFST）， 又 稱 側(cè) 流 免 疫 檢 測(cè) 技 術(shù)（Lateral flow immunoassay，LFA）。 采用該技術(shù)無需專業(yè)技能，不依賴儀器，便攜性好、使用便捷、檢測(cè)迅速、結(jié)果判定簡(jiǎn)易、干擾小、成本低[31]。隨著納米粒子與顯色手段的發(fā)展，目前免疫層析試紙已不局限于膠體金試紙[26]。采用最新研發(fā)的ASFV血清抗體量子點(diǎn)熒光檢測(cè)試紙條，配合手持式熒光免疫分析儀，可將高敏感性的量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)與側(cè)向流免疫層析技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了ASF抗體的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)POCT檢測(cè)[32]。

不同的檢測(cè)方法具有不同的特點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中選用哪一種檢測(cè)方法需要在比較每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用情景后做出取舍[23]。

2 納米抗體

納米抗體（Nanobody，Nb）作為抗體的新成員，近年來在醫(yī)藥檢測(cè)和治療領(lǐng)域的發(fā)展較為迅速。Nb較傳統(tǒng)的單克隆抗體有著更加優(yōu)越的應(yīng)用前景，可以克服傳統(tǒng)單克隆抗體制備成本高、工藝復(fù)雜，以及難以人工改造等缺點(diǎn)。

2.1 納米抗體的結(jié)構(gòu)特征

傳統(tǒng)的IgG由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈構(gòu)成，重鏈間、重鏈與輕鏈間通過二硫鍵連接，重鏈和輕鏈由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，相對(duì)分子量約為150 kDa。納米抗體是在駱駝、羊駝和鯊魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)特別的抗體，與傳統(tǒng)IgG相比，Nb體積小，呈橢圓形，通常包括骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，為凸型結(jié)構(gòu)，利于與抗原結(jié)合。故Nb特異親和力更高。單鏈抗體缺少輕鏈和重鏈CH1，只含有重鏈CH2、CH3和可變區(qū)?？乖Y(jié)合部分僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成，尺寸約是傳統(tǒng)抗體的1/10。 Nb主要依靠 3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1，CDR2，CDR3）與抗原分子結(jié)合，其氨基酸序列突變性較強(qiáng)。高變區(qū)之間骨架區(qū)的氨基酸序列變化較小[33]。

2.2 納米抗體的生物學(xué)特性

Nb結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體型小，相對(duì)分子量約為15 kDa，較小的分子量和體積使其具有較好的組織穿透力。Nb溶解度高，在于Nb骨架區(qū)FR2中的疏水氨基酸殘基突變?yōu)橛H水氨基酸殘基，因而增加了Nb的溶解性[34]。Nb穩(wěn)定性強(qiáng)、易于保存，對(duì)極端條件具有一定的抵抗力。Nb在37℃下可保存1周，在-80℃低溫下可長(zhǎng)期保存，甚至可以承受90℃的高溫、高壓以及較寬范圍的pH條件[35]。Nb抗原結(jié)合能力強(qiáng)，具有較長(zhǎng)的CDR3，能夠形成穩(wěn)定的凸型結(jié)構(gòu)，更易于進(jìn)入抗原結(jié)構(gòu)的內(nèi)部結(jié)合隱蔽的位點(diǎn)[36]。為進(jìn)一步降低Nb的免疫原性，可將特定Nb的CDR移植到人源化的支架上，獲得低免疫原性的Nb[34]。

2.3 納米抗體在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用

由于Nb結(jié)構(gòu)功能的獨(dú)特性和優(yōu)越性，因而受到廣泛關(guān)注，且已在疾病檢測(cè)治療方面得到應(yīng)用。Nb在ELISA、熒光免疫技術(shù)、免疫層析技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析等免疫學(xué)檢測(cè)中有著良好的應(yīng)用前景[37]。利用禽戊型肝炎病毒 （avian Hepatitis E virus,a HEV）ORF2截短蛋白特異性Nb建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，減少了HRP標(biāo)記的二抗的使用，縮短了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作流程。理論上能夠檢測(cè)所有基因型的禽HEV，可廣泛應(yīng)用于雞群禽HEV感染的血清學(xué)調(diào)查[38]。

3 納米抗體在非洲豬瘟檢測(cè)中的應(yīng)用及展望

Nb是天然缺失輕鏈和重鏈第一恒定區(qū)的一種單鏈抗體，分子量小、體積小、溶解性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、特異性高、易于基因改造，并具有易于用細(xì)菌大量表達(dá)生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，相較于傳統(tǒng)的單抗，Nb在診斷方面更具有開發(fā)價(jià)值[33]。

監(jiān)測(cè)ASFV的流行動(dòng)態(tài)，最終實(shí)現(xiàn)ASFV的凈化，迫切需要提高檢測(cè)水平。納米抗體在ASFV檢測(cè)中的應(yīng)用尚處于起步階段。目前以ASFV p30、p54和p72蛋白的納米抗體與HRP的融合蛋白為檢測(cè)抗體，已成功建立了ASF疫病抗體的新型競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，可用于豬血清中抗體的檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單（無需使用酶標(biāo)二抗）、便捷，敏感性強(qiáng)，特異性高和生產(chǎn)成本低，具有良好的市場(chǎng)開發(fā)前景[39-40]。