尿液蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析用于原發(fā)性腎病綜合征診斷的研究進(jìn)展

王彬淇 何強(qiáng)

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是以大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和水腫為特征的一組臨床綜合征。原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome,PNS）在腎活檢病理數(shù)據(jù)庫中約占40%，是導(dǎo)致終末期腎臟病的重要原因[1]。臨床上對PNS進(jìn)行早期診斷及早期治療有重要意義。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，既可發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病的病因標(biāo)志物，又可探討其潛在的發(fā)病機(jī)制[2]。近年來，尿液蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析在腎臟病診治中的應(yīng)用研究逐漸增多，本文就該技術(shù)用于PNS診斷的研究進(jìn)展作一綜述。

1 NS

NS是常見的腎小球疾病，其分類根據(jù)病因分為原發(fā)性和繼發(fā)性，前者的診斷主要依靠排除糖尿病腎病、狼瘡性腎炎、腎淀粉樣變性、藥物、腫瘤等繼發(fā)性因素。PNS常見的病理類型有微小病變腎病（minimal-change disease,MCD）、膜性腎?。╩embranous nephropathy,MN）、局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）、系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN）、膜增生性腎小球腎炎（membranoproliferative glomerulonephritis,MPGN）[3]。不同類型的PNS臨床癥狀多有相似，且有概率從輕癥快速進(jìn)展為終末期腎臟病。但患者臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度并不總與腎活檢中腎臟損害的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4]。大多數(shù)患者僅接受單次腎活檢以確定腎臟疾病的病理類型，在散發(fā)病例中，重復(fù)活檢可以評估療效和預(yù)后。然而，腎病活動(dòng)消退的評估對治療的動(dòng)態(tài)評價(jià)至關(guān)重要。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)與質(zhì)譜分析方法

“蛋白質(zhì)組”這一概念于1994年由澳大利亞學(xué)者首次提出，意指基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是不可預(yù)知的，它以客觀的方式來揭示分析物與疾病之間的聯(lián)系，幫助我們更廣泛地去探索疾病。隨著蛋白質(zhì)組檢測儀器、技術(shù)及生物信息學(xué)分析軟件的飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)入黃金時(shí)代。其中質(zhì)譜分析方法具有較高復(fù)用能力，并且已經(jīng)可以提供大多數(shù)目前已知的不同腎病中尿肽和蛋白質(zhì)含量的信息，以及各種疾病的潛在生物標(biāo)志物[6]。與傳統(tǒng)檢測方法相比，質(zhì)譜分析具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度、線性范圍寬及高通量等優(yōu)點(diǎn)。臨床上，質(zhì)譜分析技術(shù)可應(yīng)用于生化檢驗(yàn)、免疫學(xué)檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)及分子生物診斷等多個(gè)方面[7]。目前已有研究表明，質(zhì)譜分析方法診斷淀粉樣變腎病相較常規(guī)腎活檢免疫熒光標(biāo)記技術(shù)而言，有更高的靈敏度和特異度，并有望成為淀粉樣變腎病分型的新“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]。

目前，最常用的質(zhì)譜分析方法包括基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)及串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽技術(shù)有助于在常見的蛋白質(zhì)和多肽數(shù)量變化顯著時(shí)識(shí)別它們。一般來說，所列的非靶向質(zhì)譜方法最適合初步探索潛在生物標(biāo)志物，而靶向質(zhì)譜和免疫分析可用于進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 尿液蛋白質(zhì)組學(xué)

血液、組織液、尿液等是研究診斷性生物學(xué)標(biāo)志物的最佳臨床生物樣本。相較其他樣本蛋白質(zhì)組學(xué)分析，尿液蛋白質(zhì)組學(xué)分析有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，尿液蛋白質(zhì)組不是很復(fù)雜，其中腎臟來源的蛋白質(zhì)和多肽高達(dá)70%，而腎損傷標(biāo)志物只占高度多樣化的血液蛋白質(zhì)組中的一小部分。其次，尿液中蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物濃度比血液中更易正常化，例如肌酐[9]。第三，尿液的收集簡單且無創(chuàng)。最后，尿液樣本在-20℃的溫度下能保持穩(wěn)定，即使儲(chǔ)存多年也適合進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析[10]。尿液的上述優(yōu)點(diǎn)使其成為尋找各種病理蛋白質(zhì)標(biāo)志物的熱門課題。這些病理包括腎臟、泌尿生殖系統(tǒng)以及與蛋白尿相關(guān)的病理，如腎臟疾病[11]、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌[12]、糖尿病腎病[13]及先兆子癇[14]。尿蛋白標(biāo)志物也被用于描述結(jié)腸癌、肺癌[15]、膽管癌[16]、心血管疾病[17]、自身免疫性疾病[18]及傳染病[19]。尿液蛋白質(zhì)組可涵蓋最多的腎臟病理相關(guān)信息，并能提供不同腎臟疾病的指紋圖譜[6,20-21]。然而目前國內(nèi)外尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化仍處于早期階段，其中一個(gè)重要的限制因素就是經(jīng)濟(jì)成本。

4 常見PNS的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析研究進(jìn)展

4.1 MCD與FSGS MCD和FSGS是原發(fā)性足細(xì)胞損傷性疾病（原發(fā)性足細(xì)胞?。?，主要表現(xiàn)為大量蛋白尿和NS[22]。然而，對FSGS早期腎臟活檢的形態(tài)學(xué)研究可能會(huì)遺漏單個(gè)腎小球的節(jié)段性硬化，并可能誤診為MCD[23]。因此一些研究旨在確定這兩種腎病之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異。特別是在FSGS中，鈣網(wǎng)膜蛋白和尿泛素核糖體結(jié)合蛋白52水平較高[24-25]，而39S核糖體蛋白L17在MCD中含量較高[24]。在FSGS的塌陷變異型（以腎小球塌陷和腎功能快速喪失為特征）病例中，組織蛋白酶B、組織蛋白酶C和膜聯(lián)蛋白A3的水平明顯高于MCD、MN和其他FSGS變異型患者[26]。

一些僅針對FSGS的潛在標(biāo)志物包括類鈣黏蛋白26、RNaseA 家族 1、DIS3樣核酸外切酶 1[27]、基質(zhì)重塑蛋白 8（matrix-remodeling protein 8,MXRA8）[28]、CD59、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7和ROBO4[29]，以及多聚免疫球蛋白受體和高爾基體相關(guān)嗅覺信號(hào)調(diào)節(jié)因子[30]或完全缺乏的二肽酶1[29]。而僅在MCD患者中發(fā)現(xiàn)有CD14水平的升高[27]，這是在其他腎病中都未發(fā)現(xiàn)的。同時(shí)，轉(zhuǎn)鐵蛋白和富組蛋白-3的升高可能將FSGS和MCD與其他類型的腎臟疾病區(qū)分開來[24]。在已發(fā)現(xiàn)的潛在標(biāo)志物中，核糖核酸酶2的過度表達(dá)和結(jié)合珠蛋白的低表達(dá)可能提示FSGS的最差預(yù)后，而載脂蛋白A1和MXRA8在類固醇敏感和類固醇耐藥的FSGS之間表現(xiàn)出顯著變化[28]。

尿液中大多數(shù)上述蛋白的存在及其水平的升高可能反映了足細(xì)胞與腎小球分離過程中大量細(xì)胞死亡和細(xì)胞內(nèi)容物釋放。這些結(jié)果也可能提示免疫、炎癥和細(xì)胞凋亡在FSGS發(fā)展過程中的特殊作用。細(xì)胞增殖、分化和死亡可能與MCD的發(fā)展有關(guān)[31]。利用阿霉素FSGS大鼠模型進(jìn)行的動(dòng)態(tài)研究顯示，Afamin和銅藍(lán)蛋白逐漸增加，而鈣黏蛋白-2和聚集蛋白聚糖核心蛋白逐漸減少，提示胎球蛋白B、α1微球蛋白和α2-HS-糖蛋白水平的降低可能有望成為早期發(fā)現(xiàn)FSGS的標(biāo)志物[32]。其他有希望的標(biāo)志物包括CD44、MXRA8、組織蛋白酶和載脂蛋白A1。CD44反映了壁層上皮細(xì)胞的激活，從而引發(fā)了腎小球硬化。MXRA8、組織蛋白酶參與纖維化累積和疾病進(jìn)展。載脂蛋白A1反映氧化應(yīng)激與高脂血癥有關(guān)，是FSGS發(fā)生、發(fā)展的致病因素之一。

4.2 MN MN是成人PN的主要病因。MN的主要機(jī)制是抗磷脂酶A2受體（phospholipase A2 receptor,PLA2R）抗體對足細(xì)胞的自身免疫性損傷，導(dǎo)致大量蛋白尿。目前對該病的診斷和治療主要基于PLA2R抗體滴度測定。在PLA2R抗體陰性的特發(fā)性MN中有望找到其他標(biāo)志物。

區(qū)分MN與其他腎病的特異性尿蛋白標(biāo)志物包括鋅指蛋白ZFPM2、E1A結(jié)合蛋白、微管相關(guān)蛋白tau、AP3D1蛋白的水平降低[30]。以及甲狀腺素結(jié)合球蛋白[27]、溶酶體膜蛋白-2（lysosome membrane protein-2,LIMP-2）[33]、纖溶酶原[30]、LDB3、PDLI5[22]及 Afamin[34-35]水平升高。對APLA2R陽性的MN和APLA2R陰性的MN患者以及健康個(gè)體的樣本進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)陽性MN組的α1-抗胰蛋白酶和Afamin水平顯著升高[36]。

尿視黃醇結(jié)合蛋白4和SH3結(jié)構(gòu)域富谷氨酸富集樣蛋白3相結(jié)合可以區(qū)分MCD和糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）。類似地，尿Afamin和血漿C3的比值相結(jié)合可以區(qū)分MN和DN[34]。

一般來說，在MN中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物在補(bǔ)體激活和免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、血小板脫顆粒和凝血級聯(lián)等經(jīng)典途徑中發(fā)揮作用[35]。LIMP-2在腎組織炎癥免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[33]，反映了免疫細(xì)胞的組織浸潤。LIMP-2也可能有助于確定疾病活動(dòng)性。LDB3和PDLI5蛋白在足細(xì)胞細(xì)胞骨架的修飾中發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致蛋白尿。Afamin的升高與特發(fā)性MN有關(guān)，它的重要性已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)，是最有希望的特異性MN標(biāo)志物。

4.3 MsPGN MsPGN是我國原發(fā)性腎小球疾病中最常見的病理類型，約占PNS的30%。主要病理特征為彌漫性腎小球系膜細(xì)胞增生及不同程度系膜基質(zhì)增多。目前一般認(rèn)為本病是由于免疫紊亂造成的腎臟炎癥損傷，據(jù)其免疫病理可將MsPGN分為IgA及非IgA兩大類，其中IgA為最常見的類型[37]。在歐洲，IgA腎病的發(fā)生率在腎小球疾病的腎活檢中達(dá)19%到51%[38-40]。

目前已發(fā)現(xiàn)大約40種尿蛋白標(biāo)志物可區(qū)分IgA腎病，其中IgA腎病的特異性標(biāo)志物超過20種。在本團(tuán)隊(duì)的前期研究中，對50例IgA腎病患者及50名健康人的尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Eph受體A4和profilin-2蛋白在IgA腎病患者的尿液樣本中顯著上調(diào)，而分泌跨膜蛋白1和腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2則顯著下降[41]。在IgA腎病患者的腎小球（活檢樣本）中，C9、免疫球蛋白k鏈C結(jié)構(gòu)域和3種細(xì)胞骨架角蛋白（I型細(xì)胞骨架角蛋白10、Ⅱ型細(xì)胞骨架角蛋白1、Ⅱ型細(xì)胞骨架角蛋白5）的水平與腫瘤患者腎組織間區(qū)同步變化[42]。在腎功能穩(wěn)定及少量蛋白尿的IgA腎病中發(fā)現(xiàn)了30種尿蛋白和4個(gè)潛在標(biāo)志物（細(xì)胞間黏附分子1、金屬蛋白酶抑制劑1、抗凝血酶Ⅲ、脂聯(lián)素）的水平改變。一項(xiàng)更大規(guī)模的多中心研究表明，進(jìn)展性IgA腎病患者尿液中膠原片段的數(shù)量減少（尤其是Ⅰ型膠原）可能是由于腎臟纖維化中膠原降解減少和膠原酶的抑制[43]。

其他潛在的IgA腎病特異性標(biāo)志物包括脂聯(lián)素[44]、α2-巨球蛋白、C4a、凝血酶原、抗凝血酶Ⅲ[44]、α1-B-糖蛋白[45]、糖蛋白2、表皮生長因子、CMRF35樣分子、原鈣黏蛋白、子宮球蛋白、二肽基肽酶Ⅳ、非霍奇金淋巴瘤重復(fù)蛋白3和CD84[46]水平增加，以及fibulin-5、YIPF3、SAP[47]、氨基肽酶 N[48]及 endorepellin 的 LG3片段水平降低[45]。最后一個(gè)是腎小球?yàn)V過率較低的較重IgA腎病患者中唯一降低的蛋白[45]。同時(shí)，高LG3水平可抑制血管生成，并導(dǎo)致一些IgA腎病患者的腎功能喪失[45]。雖然關(guān)于VASN水平變化的數(shù)據(jù)不一致[46,48]，但它也可以被認(rèn)為是特異性的IgA腎病標(biāo)志物。特別值得注意的是，抗凝血酶Ⅲ是唯一在兩項(xiàng)獨(dú)立研究中證實(shí)的特異性IgA腎病標(biāo)志物。

5 小結(jié)

目前，腎活檢組織病理仍是診斷腎臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有一定的創(chuàng)傷性，且臨床應(yīng)用受限。而蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析在腎臟疾病的非侵入性診斷、闡明疾病進(jìn)展的主要發(fā)病機(jī)制、確定抑制疾病進(jìn)展的作用靶點(diǎn)等方面具有巨大潛力。其主要特點(diǎn)是，尿液中檢測到的許多標(biāo)志物都是蛋白質(zhì)從血液中滲透出來的結(jié)果。與腎活檢相比，尿液蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析更安全可靠且能動(dòng)態(tài)觀察疾病的發(fā)展進(jìn)程及預(yù)后評估。同時(shí)尿液蛋白質(zhì)組學(xué)譜能提供檢查時(shí)腎臟主要病理過程的有價(jià)值信息。

PNS患者尿蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析的最重要目標(biāo)之一是確定疾病特異性生物標(biāo)志物或其組合。第一次提取的蛋白質(zhì)最值得關(guān)注，因?yàn)樗鼈円苍S能反映疾病發(fā)展中最重要的發(fā)病階段。例如，CD44，一個(gè)被激活的壁上皮細(xì)胞標(biāo)志物，可能反映了MN[27]或IgA腎病[6]腎小球硬化的過程，但同時(shí)也可能是區(qū)分FSGS和MCD[29]的一個(gè)重要特征。

此外，指定療法后蛋白質(zhì)組圖譜的動(dòng)態(tài)變化可能有助于確認(rèn)藥物的選擇是否正確，并有助于達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。然而，影響蛋白質(zhì)組組成的因素很多，包括采集條件和采集方式（早上、每天、幾天內(nèi)的變化情況等）、體力活動(dòng)、營養(yǎng)情況、泌尿系統(tǒng)的解剖特征（如缺少一個(gè)腎臟等）以及性別和年齡[49-50]。在比較不同研究的結(jié)果時(shí)，所有這些因素都應(yīng)該被考慮在內(nèi)。由于國內(nèi)外對腎臟疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的研究仍是單中心研究較多，樣本數(shù)量有限，因此，目前仍沒有可靠的腎臟疾病特異性生物標(biāo)志物可在不同的研究中準(zhǔn)確再現(xiàn)。一般來說，將不同研究中概述的特定腎病標(biāo)志物相結(jié)合，可以促進(jìn)在多階段前瞻性驗(yàn)證后更好地創(chuàng)建高特異性區(qū)分模型以供臨床使用[51]。