乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的臨床應(yīng)用

謝建棟 綜述 熊 斌,2△ 審校

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272013;2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272029)

根據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計顯示[1]，全世界癌癥的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，女性乳腺癌已經(jīng)超過肺癌成為最常見的癌癥類型，死亡率位居第五。乳腺癌患者的死亡與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率密切相關(guān)，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)往往會使癌癥患者難以治愈，走向死亡。這種轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展由循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)所介導(dǎo)，這種由惡性腫瘤排出能夠侵入周圍組織并進(jìn)入淋巴及血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，會在全身其他組織和器官部位建立新的轉(zhuǎn)移，最終造成患者死亡[2]。因此，CTC在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。

1 CTC

1869年，澳大利亞Ashworth教授[3]通過觀察1例轉(zhuǎn)移性癌癥患者的外周血，首次發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞，其形態(tài)與原發(fā)腫瘤相似，故將其命名為CTC。目前，CTC定義為自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。CTC自腫瘤脫落后進(jìn)入血液，由于受到機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊，其半衰期在1～2.5h。然而，少數(shù)存活CTC可引起遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性疾病[4]。血液中的CTC相對于其他血細(xì)胞(如白細(xì)胞、紅細(xì)胞)來說較少，106～107個白細(xì)胞中可能僅有1個CTC。CTC可以單獨或成簇地在血液系統(tǒng)中循環(huán)，CTC簇很少見，但它們比單個CTC具有更大的發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[5]。CTC存在不同類型，包括上皮細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞表型和上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞混合表型，這是由于腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入外周血循環(huán)的過程中會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。在EMT中，原本應(yīng)分化為上皮組織的細(xì)胞失去了原有分化方向，反而獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性和能力，具有更強的遷移和侵襲能力[6]。CTC可以與中性粒細(xì)胞結(jié)合，這種中性粒細(xì)胞和CTC之間的相互作用促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)展，增加了CTC的轉(zhuǎn)移潛力，使患者的無進(jìn)展生存期(progress free survival,PFS)成倍的縮短[7]。

2 CTC檢測方法(富集和鑒定)

2.1 基于物理特性的富集

基于物理特性可以快速分離CTC而無須進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)記。代表檢測方法包括：利用密度差異的密度梯度離心法，利用細(xì)胞大小差異的膜濾過分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)(ISET)，利用介電性質(zhì)差異的介電泳場流分離(DEP-FFF)，利用變形性差異的微流分離平臺[8]?；谖锢硖匦缘姆蛛x技術(shù)提供了高通量富集的可能，但由于CTC的大小和異質(zhì)性，目前的技術(shù)存在很大的局限性。

2.2 基于生物學(xué)特性的富集

基于生物學(xué)特性主要使用針對腫瘤相關(guān)抗原(陽性富集)或共同白細(xì)胞抗原CD45(陰性富集)抗體的免疫學(xué)方法。陽性富集通常采用抗上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的抗體。EpCAM是上皮源性癌癥的常見標(biāo)記蛋白，而白細(xì)胞不表達(dá)[9]。在目前基于EpCAM的技術(shù)，自動化Cell Search?系統(tǒng)能夠可靠地檢測血液中的CTC，適用于臨床實驗室對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的常規(guī)評估[10]。過去10年，使用EpCAM檢測癌癥患者血液中CTC的方法數(shù)量有所增加，例如 Magsweeper、MACS、Strep-Tactin、CTC-Chip和GO芯片。但面對EMT的CTC，由于EpCAM是陰性的，不能通過抗EpCAM抗體的檢測來分離，面臨著這一部分的CTC的丟失。陰性富集通常是通過靶定CD45去除白細(xì)胞，使CTC被富集沉淀。近年來用于分離CTC的EPISPOT(epithelial immunospot)技術(shù)就是采用的此種方法，雖可以獲取全部特征的CTC，但面臨著純度方面的問題。

2.3 細(xì)胞鑒定

CTC分子檢測方法包括利用熒光原位雜交(FISH)檢測基因組擴(kuò)增，免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)檢測蛋白質(zhì)標(biāo)記物，RT-PCR/qRT-PCR檢測特異性RNA和DNA序列，可以鑒定CTC。

3 CTC計數(shù)在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

3.1 在轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)中的應(yīng)用

Cristofanilli等[11]對177名MBC患者采用Cell Search系統(tǒng)行CTC計數(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)CTC≥5個/7.5ml血液相較于CTC<5個/7.5ml血液的PFS和總體生存期(Overall survival，OS)更短，證明了CTC在疾病期間具有預(yù)后價值。低水平CTC比高水平CTC的PFS和OS明顯增加，說明在MBC治療進(jìn)程中任何時間CTC的升高提示病情可能惡化[12]。Larsson等[13]的一項前瞻性研究納入了156名首次診斷為MBC女性患者6個月的CTC和CTC簇的動態(tài)監(jiān)測。從所有研究時間點來看，CTC計數(shù)升高、≥5 CTC和CTC簇的檢測均可預(yù)測預(yù)后，隨著時間的推移，預(yù)后價值增加。這表明CTC水平的動態(tài)變化與預(yù)后的相關(guān)性比僅基線計數(shù)更重要。此外，與簡單的CTC計數(shù)相比，CTC簇的存在增加了更重要的預(yù)后價值。監(jiān)測接受全身治療的MBC患者血液中的CTC和CTC簇可能會提供有關(guān)終點臨床結(jié)局的重要預(yù)后信息。MBC患者死亡率與CTC簇?zé)o關(guān)，而是取決于CTC的數(shù)量。CTC 是疾病IV期患者分層的理想選擇。IV期惰性患者(<5CTC)的OS比IV期侵襲性患者(>5CTC，36.3個月vs 16個月) 更長，與疾病亞型無關(guān)。因此，CTC計數(shù)可作為晚期疾病分期和疾病分層的重要工具。

3.2 在早期乳腺癌中的應(yīng)用

相較于MBC，CTC在早期乳腺癌中的臨床價值受到限制，主要由于CTC在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌中尤為罕見，通常發(fā)現(xiàn)少于1個CTC/10mL血液，其中5個或更多CTC是罕見事件(1%～5.9%)。使用比MBC(每 7.5mL血液≥5個CTC)更低的閾值(每7.5mL血液≥1個CTC)在診斷時，約20%至25%的非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者可檢測到CTC[14]。與MBC類似，CTC可以提供獨立的預(yù)后信息[15]。最近的國際薈萃分析(IMENEO研究)[14]基于來自16個中心接受新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NCT)治療的2000多名早期乳腺癌患者，結(jié)果顯示CTC計數(shù)是無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存、OS和局部復(fù)發(fā)的強有力且獨立的預(yù)后指標(biāo)。重要的是，對生存的影響與檢測到的CTC的數(shù)量有關(guān)，隨著CTC數(shù)量1個到5個或更多，死亡風(fēng)險比顯著增加。該研究表明CTC計數(shù)是NCT治療的早期乳腺癌患者的獨立和定量預(yù)后因素。Goodman等[16]的一項回顧性研究表明，早期乳腺癌患者手術(shù)后的CTC檢測可預(yù)測輔助放療的益處。這表明CTC計數(shù)可用于指導(dǎo)臨床醫(yī)生確定哪些患者將從放射治療中受益。Trapp等[17]研究發(fā)現(xiàn)化療兩年后CTC的存在與無病生存期(DFS)和OS降低有關(guān)。證實了CTC可以作為化療后乳腺癌常規(guī)隨訪期間的預(yù)后監(jiān)測標(biāo)志物。而在新輔助化療方面，Gwark等[18]研究發(fā)現(xiàn)NCT后有未達(dá)到病理完全緩解(pCR)和CTC≥5的患者顯示出具有較差的OS。Spring等[19]薈萃分析在NCT后實現(xiàn)pCR可顯著改善乳腺癌患者PFS和OS，特別是對于三陰性乳腺癌和HER-2陽性的乳腺癌。Ni等[20]研究發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)隨NCT的應(yīng)用而減少，術(shù)前CTC陽性而NCT后轉(zhuǎn)為陰性的CTC患者的pCR比率高于其他組。但O'Toole等[21]研究顯示在pCR的患者中，NCT后CTC仍然存在，這一發(fā)現(xiàn)表明CTC計數(shù)可能不適合替代病理學(xué)評估新輔助化療的效果。在一項前瞻性試驗Treat-CTC[22]中，63名在新輔助化療和手術(shù)后患有非轉(zhuǎn)移性HER-2陰性乳腺癌且可檢測到CTC的患者被隨機(jī)分配至曲妥珠單抗(赫賽汀)或觀察組。試驗的主要終點第18周CTC計數(shù)沒有差異，試驗因無效而停止。這種陰性結(jié)果可能與CTC的HER-2狀態(tài)有關(guān)，因為在研究中不要求CTC必須是HER-2陽性。事實上，大多數(shù)患者(76%)CTC呈陽性。Treat-CTC試驗的失敗與選擇不適當(dāng)?shù)闹委煾深A(yù)有關(guān)，不能夠說明基于CTC變化的治療決策是無效的。

4 CTC分子分析在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

隨著CTC檢測的進(jìn)步，除了計數(shù)之外，從患者血液中有效分離出的CTC可以進(jìn)行詳細(xì)的分子分析，包括檢測遺傳和表觀遺傳變化、表達(dá)譜和表型篩選。近年來，CTC的單細(xì)胞測序已得到廣泛研究，能夠揭示CTC的基因組和轉(zhuǎn)錄組。CTC表型是治療反應(yīng)的另一個重要預(yù)測因子。CirCe T-DM1研究[23]是第一個不使用CTC數(shù)量而是表型作為決策標(biāo)準(zhǔn)的臨床試驗。共篩選了155名患者，14名(9.0%)患有HER-2陽性CTC，11名患者接受了TDM-1治療。僅在一名患者中觀察到部分反應(yīng)。由于這些結(jié)果以及HER-2陽性CTC的患病率非常低(占檢測到的CTC的1.6%)，結(jié)論認(rèn)為，所測試的治療方法沒有前景。Guan等[24]研究得出使用總CTC計數(shù)和間充質(zhì)CTC比例的聯(lián)合指標(biāo)在HER-2陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的預(yù)后評估和療效監(jiān)測中較單純地使用總CTC計數(shù)具有更高的敏感性。CTC表型表現(xiàn)出很大的動態(tài)變化趨勢，這與治療反應(yīng)的變化有關(guān)。這種基于EMT標(biāo)志物的簡單實用的CTC檢測方法可以實現(xiàn)對治療反應(yīng)的動態(tài)監(jiān)測，并可能對MBC個性化治療做出很大貢獻(xiàn)。MBC患者大多數(shù)CTC為ER、PR陰性，而原發(fā)性腫瘤卻為陽性。這可能反映了一種逃避內(nèi)分泌治療的機(jī)制。與此相反，在ER、PR陰性乳腺癌中，原發(fā)性腫瘤和CTC之間受體狀態(tài)的變化通常很小。Papadaki等[25]研究證實在那些患有MBC且對治療方案沒有反應(yīng)的患者中，化療后上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞混合表型人群增加了，此亞群是PFS降低的獨立預(yù)測因素，在HER-2陰性患者中，它也可預(yù)測OS降低。深入分析CTC的分子分型有助于理解腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制和耐藥機(jī)制[26]。理想情況下，CTC下游分子表征的改進(jìn)將最終導(dǎo)致針對乳腺癌轉(zhuǎn)移過程的定制藥物的開發(fā)。Wang等[27]測量了105名HER-2陰性的MBC患者的CTC的HER-2 表達(dá)，結(jié)果說明了CTC在檢測HER-2不一致和預(yù)測對HER-2靶向治療的反應(yīng)方面的潛在效用。

5 小結(jié)與展望

CTC檢測目前主要應(yīng)用在乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評估、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測、療效評價及腫瘤的個體化治療等方面。尤其是CTC的定量和定性檢測已被應(yīng)用于快速評估化療和靶向治療的療效、預(yù)測預(yù)后、實時監(jiān)測治療耐藥和癌癥復(fù)發(fā)。在CTC的分子檢測和表征方面也取得了相關(guān)進(jìn)展，但是我們對CTC功能特性的知識仍然有限，應(yīng)用仍然主要局限于研究目的和臨床研究，仍然缺乏臨床有效性的證據(jù)，尤其是臨床實用性方面。在檢測技術(shù)方面，雖然目前的CTC分離技術(shù)和產(chǎn)品種類繁多，很多開發(fā)的新技術(shù)顯著提高了CTC檢測的靈敏度和計數(shù)的準(zhǔn)確性，但仍面臨著眾多的CTC檢測技術(shù)無法進(jìn)行評估和相互比較的問題，仍需尋找靈敏度和特異度更高的檢測方法，以及對檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相統(tǒng)一。這需要在分析前階段對樣本處理進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化程序，或建立CTC分子分析的可重復(fù)工作流程?？傊P(guān)于CTC在轉(zhuǎn)移過程中的生物學(xué)機(jī)制和臨床影響，以及更深層次的認(rèn)識和了解，還有待進(jìn)一步的研究。