數(shù)字PCR在食品安全檢測中的應(yīng)用

鄭雯馨，滕 達(dá)

（內(nèi)蒙古中普檢驗(yàn)檢測有限公司，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

近年來，在食品領(lǐng)域，我國與世界各個(gè)國家的貿(mào)易合作不斷被深化，食品安全也開始成為市場監(jiān)管的關(guān)鍵[1]。根據(jù)調(diào)查，在國際食品貿(mào)易當(dāng)中，每年由于食品中摻雜動植物源成分或者由于失信問題而造成的損失超過400億美元。在這樣的背景下，運(yùn)用非培養(yǎng)宿主式的檢測方法是十分重要的，這種方法具有精準(zhǔn)、快速的特點(diǎn)，可以有效降低在生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售以及儲存等環(huán)節(jié)中出現(xiàn)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可以提高對各類食品的監(jiān)管效率。數(shù)字PCR技術(shù)在這樣的背景下出現(xiàn)，且已得到了廣泛的應(yīng)用。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的概述

數(shù)字PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的方法。該技術(shù)可以被細(xì)分為微滴式和芯片式兩種類型。其中微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的特點(diǎn)是將待檢測樣本反應(yīng)液分為由若干乳液包裹的微液滴，需要對不同的微滴內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并對熒光信號進(jìn)行檢測，最后根據(jù)相應(yīng)的比重來對目的序列的含量進(jìn)行檢測和計(jì)算。而芯片式數(shù)字PCR技術(shù)則需要利用微流控技術(shù)將反應(yīng)倉導(dǎo)入到芯片上，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。此外，還可以利用相近基因芯片法對反應(yīng)倉中的熒光信號進(jìn)行檢測，并對目的序列含量進(jìn)行計(jì)算和判斷。上述方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，樣品都會發(fā)生20 000多個(gè)PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)定量檢測的要求[2]。

數(shù)字PCR技術(shù)包括以下3個(gè)應(yīng)用步驟。①稀釋核酸模板，然后將其分配到獨(dú)立的反應(yīng)單元當(dāng)中，不同單元所對應(yīng)的DNA模板分子是不同的。②在反應(yīng)單元中開展PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并在反應(yīng)完成后統(tǒng)計(jì)熒光信號。③統(tǒng)計(jì)熒光信號陽性結(jié)果在反應(yīng)單元中的比例，然后推算核酸序列拷貝數(shù)。

2 數(shù)字PCR在食品安全檢測中的應(yīng)用優(yōu)勢

2.1 方便性

在過去，食品安全檢測過程需要開展大量復(fù)雜的操作，這些操作不僅需要較長的時(shí)間才能完成，同時(shí)也需要投入大量的人工成本和材料成本，這導(dǎo)致相關(guān)檢測部門和檢測企業(yè)的資金投入過多[3]。而在數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用后，整個(gè)檢測過程操作方便，顯著降低了成本投入。這是因?yàn)閿?shù)字PCR技術(shù)可以借助自動化設(shè)備對食品中的微生物含量和種類進(jìn)行檢測，縮短了檢測時(shí)間，同時(shí)使檢測活動具有周期性。由此可見，數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用使相關(guān)操作變得簡單與方便，實(shí)現(xiàn)了由多人食品安全檢測到一人檢測的轉(zhuǎn)變，減少了人工投入。

2.2 快捷性

在食品安全檢測中，腐敗菌的檢測周期通常在2～5 d，這難以滿足實(shí)際檢測需要，在檢測結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)之間表現(xiàn)出了時(shí)間上的落差，具有滯后性的特點(diǎn)。當(dāng)檢測結(jié)果出來時(shí)，很多食品都已經(jīng)被投放到市場。而數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用可以有效解決這一問題，具有快捷性的特征，能夠大幅度縮短食品中腐敗菌的檢測周期，通常在24 h內(nèi)就可以獲得檢測結(jié)果。簡單的食品檢測項(xiàng)目的檢測時(shí)間可以控制在5 h左右，不會對市場銷售產(chǎn)生影響，提高了市場投放效率，能夠?yàn)槭称飞a(chǎn)企業(yè)的發(fā)展提供推動力。

2.3 準(zhǔn)確性

與其他產(chǎn)品相似，食品在投放市場的過程中需要經(jīng)歷出庫、運(yùn)輸、貨架擺放等一系列過程[4]。在這個(gè)過程中，食品可能會受到微生物污染，進(jìn)而影響食用者的生命健康。而傳統(tǒng)食品安全檢測方法，難以將污染性微生物從食品中剝離，同時(shí)也難以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。數(shù)字PCR技術(shù)可以有效解決以上問題，能夠確定食品中的微生物種類和含量，提高了檢測的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

3 數(shù)字PCR在食品安全檢測中的具體應(yīng)用

3.1 在沙門氏菌檢測中的具體應(yīng)用

在食品安全檢測過程中，需要將沙門氏菌檢測作為重點(diǎn)工作。除了常規(guī)的數(shù)字PCR技術(shù)之外，套式技術(shù)和多重技術(shù)都在該領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。在檢測要求高、檢測條件復(fù)雜的場合，單獨(dú)使用某種技術(shù)難以達(dá)到預(yù)期的效果，因此需要合并使用多種技術(shù)來對多種病菌進(jìn)行同時(shí)檢測[5]。尤其是在玉米、番茄等轉(zhuǎn)基因類食品的檢測中，多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)在方便快捷方面的應(yīng)用優(yōu)勢十分明顯。數(shù)字PCR技術(shù)對沙門氏菌的檢測步驟如下。①根據(jù)沙門氏菌的基因設(shè)計(jì)一對引物以及基因擴(kuò)增片段。②設(shè)置合適的反應(yīng)條件，確保在該條件下引物可與沙門氏菌產(chǎn)生反應(yīng)。③在兩條引物之間設(shè)計(jì)半套式引物，進(jìn)而準(zhǔn)確檢測擴(kuò)增結(jié)果。

3.2 在李斯特菌檢測中的具體應(yīng)用

李斯特菌廣泛存在于環(huán)境中。該種細(xì)菌將食物作為傳染源，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致命性。如果食品中李斯特菌的含量比較低，人們在食用后并不會出現(xiàn)明顯的反應(yīng)，但如果含量超過一定的數(shù)量，則會表現(xiàn)出食物中毒癥狀，嚴(yán)重情況下會出現(xiàn)血液和腦組織感染。從基因?qū)W角度來講，李斯特菌中的致病因子主要是李氏溶血素O基因和內(nèi)化素基因。數(shù)字PCR技術(shù)可以將這兩種基因檢測出來，不會影響抑制酶的活性。在使用數(shù)字PCR技術(shù)對李斯特菌進(jìn)行檢測時(shí)，要對擴(kuò)散的李斯特菌進(jìn)行培養(yǎng)，且要運(yùn)用化學(xué)法來對培養(yǎng)成功的物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)抽離，去除其中的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，以免影響檢測結(jié)果。此外，還要通過加熱分解的形式來提高細(xì)菌的檢出率。

3.3 在金黃色葡萄球菌檢測中的具體應(yīng)用

金黃色葡萄球菌被稱為“嗜肉菌”，屬于葡萄球菌，廣泛存在于空氣、水和灰塵中。其可使奶類、肉類、蛋類、魚類及其制品出現(xiàn)質(zhì)量安全問題。數(shù)字PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測中發(fā)揮了重要作用。在過去，檢測金黃色葡萄球菌時(shí)，需要先培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，而數(shù)字PCR技術(shù)可以在不培養(yǎng)的情況下直接進(jìn)行檢測，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的便捷性，同時(shí)縮短了檢測周期。但也正是如此，在檢測的時(shí)候其他病菌容易滲透和侵入。在這樣的情況下，使用數(shù)字PCR技術(shù)對金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測時(shí)，需要將大腸桿菌作為干擾，這樣可以避免其他病菌對檢測結(jié)果的影響，同時(shí)能在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地將病原菌檢測出來。但在這個(gè)過程中要確保大腸桿菌的數(shù)量大于金黃色葡萄球菌的數(shù)量。

3.4 在水產(chǎn)養(yǎng)殖動植物類食品中的安全檢測

為了應(yīng)對市場需求，近年來我國水產(chǎn)養(yǎng)殖呈現(xiàn)出了集約化與規(guī)?；陌l(fā)展趨勢，這也對相關(guān)食品的安全檢測工作提出了更高的要求。水產(chǎn)生物的致病菌呈現(xiàn)出了由單一化到多元化和復(fù)雜化的轉(zhuǎn)變，這不僅影響到了水產(chǎn)養(yǎng)殖的效果，同時(shí)也影響到了相關(guān)食品的安全，進(jìn)而會制約行業(yè)的發(fā)展。而數(shù)字PCR技術(shù)可以利用基因序列的保守性來進(jìn)行安全檢測，建立檢定擬態(tài)弧菌的專門PCR技術(shù)，增強(qiáng)對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌等多種病原菌檢測的精準(zhǔn)性。除了能夠?qū)λa(chǎn)養(yǎng)殖動植物類食品中的病原菌含量進(jìn)行檢測之外，還可以計(jì)算出病原菌的發(fā)展周期，這不僅確保了相關(guān)食品的安全性，同時(shí)也為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的安全生產(chǎn)提供了保障。

3.5 在生鮮肉類食品中的安全檢測

在生活水平不斷提高的背景下，人們對生鮮肉類食品的需求也在增加，相關(guān)檢測單位將這類食品的安全檢測作為了重點(diǎn)。但市場上生鮮肉的種類比較多，品質(zhì)也表現(xiàn)出了明顯的差異，這增加了檢測的難度。數(shù)字PCR技術(shù)可以從生鮮類食品的肌肉細(xì)胞線粒體中提取出相應(yīng)的DNA，并合理選擇和設(shè)計(jì)引物，在擴(kuò)增之后得到DNA片段，然后開展檢測工作。通過這種方式，可以縮短檢測周期，部分檢測單位能夠在5 h左右得到檢測結(jié)果，大大縮短了從檢測到食品投放的時(shí)間，滿足了人們對生鮮肉在安全和新鮮方面的需求[6]。

4 數(shù)字PCR在食品安全檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

4.1 轉(zhuǎn)基因檢測

數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品的檢測方面發(fā)揮了重要作用。目前常用的方法為dPCR定性分析法和qPCR定量分析法。其中qPCR定量分析法在應(yīng)用的過程中容易受到轉(zhuǎn)基因核酸含量與基質(zhì)的影響，而dPCR定性分析法所受的影響比較小，因此應(yīng)用范圍更廣，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的靈敏性和較高的拷貝數(shù)分辨精度。

4.2 動物源成分摻雜

在肉制品生產(chǎn)過程中，部分非法分子會在其中摻雜一些未注明的肉類成分。其中常見的是在高價(jià)格的肉制品當(dāng)中摻雜低廉的肉制品，這損害了消費(fèi)者的利益，同時(shí)也在食品安全方面增加了隱患。而通過數(shù)字PCR技術(shù)，可以對肉制品當(dāng)中的動物源成分進(jìn)行精準(zhǔn)、定量測量，同時(shí)還可以對摻雜的成分進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。①利用數(shù)字PCR技術(shù)可以測定動物源成分的準(zhǔn)確拷貝數(shù)，經(jīng)過計(jì)算之后得到拷貝數(shù)與樣本質(zhì)量的比例數(shù)，然后將其與標(biāo)準(zhǔn)比例數(shù)進(jìn)行對比，以此來判斷產(chǎn)品中目標(biāo)動物源成分的摻雜情況。②通過直接拷貝數(shù)的比例可以對摻雜情況進(jìn)行判別。這需要工作人員從不同類型動物組織或者含有動物源的食物當(dāng)中提取核酸，然后對各種類目標(biāo)基因的拷貝數(shù)比值進(jìn)行測量，明確基因拷貝數(shù)和質(zhì)量之間的關(guān)系，然后基于該比例關(guān)系換算出不同種類物質(zhì)的添加量，以此來實(shí)現(xiàn)對動物源成分的定量檢測。

5 結(jié)語

綜上所述，近年來，多樣化轉(zhuǎn)基因生物的出現(xiàn)使食品安全檢測的復(fù)雜性增強(qiáng)，同時(shí)也使檢測難度進(jìn)一步提升。微生物種類多樣、構(gòu)型復(fù)雜以及感染宿主范圍廣泛，這也增加了食品安全檢測的難度。數(shù)字PCR技術(shù)具有方便性、快捷性和準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，在沙門氏菌檢測、李斯特菌檢測以及金黃色葡萄球菌檢測等方面都表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用優(yōu)勢。同時(shí)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖動植物類食品和生鮮肉類食品的安全提供了保障。