大豆球蛋白G5A3亞基加工破壞表位的初步定位

王一超， 席 俊， 陳慧彬， 李英英， 段宇瑩， 孫富宇

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

隨著生活水平的不斷提高，人們對食品安全也更加重視，其中食物過敏現(xiàn)象頗受關(guān)注，大豆是主要食物過敏原之一，在全球過敏人口中大約有25%的患者對大豆過敏[1-3]。大豆過敏是由過敏原蛋白引起的異常的免疫反應(yīng)，且其免疫原性與蛋白結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系[4,5]，研究表明當(dāng)抗原分子高級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度增加，其致敏性隨之增強(qiáng)，結(jié)構(gòu)丟失和隱藏的表位也可能產(chǎn)生類似的影響[6]。因抗原的致敏性與其結(jié)構(gòu)特征緊密關(guān)聯(lián)，所以當(dāng)前食品工業(yè)中常用的過敏原脫敏方法有超高壓法，熱處理，化學(xué)法及酶解法[7-10]，同時，也有研究從遺傳育種角度，借助基因工程的方法從根本上解決植物蛋白的致敏性問題[11]。

大豆球蛋白是從大豆中獲取的被分隔儲存的蛋白質(zhì)[12-14]，占11S組分的85%，所以又稱為11S球蛋白，是重要的致敏原，分子質(zhì)量約為350 ku，每個大豆球蛋白有6個亞基，每個亞基由酸性肽鏈(35～37 ku)和堿性肽鏈(20 ku)通過二硫鍵連接而成[15]?？乖砦皇堑鞍踪|(zhì)抗原性的依據(jù)，目前可以采用定位并破壞抗原表位的方法來降低大豆致敏性[16,17]，常用的抗原表位預(yù)測技術(shù)和抗原表位定位技術(shù)均采用信息學(xué)軟件進(jìn)行分析，其中，T7噬菌體展示系統(tǒng)[18]能夠表達(dá)不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性高，復(fù)制周期短，能夠感染大腸桿菌并形成噬菌體斑塊[19]，利用噬菌體表達(dá)蛋白并進(jìn)行純化，通過硫酸銨純化的抗體[20]鑒定表達(dá)蛋白的抗原表性。本研究團(tuán)隊通過噬菌體表達(dá)蛋白和ELISA法確定β-conglycinin的α亞基抗原性最高的氨基酸序列，分別為380EGQ-SKR408、404ALS-EKN448[21]；皮江一[22]通過將外源基因與噬菌體載體連接，在噬菌體中表達(dá)外源蛋白質(zhì)并通過鑒定，定位到β-conglycinin的β亞基的致敏性氨基酸序列為378DNV-AQD400。實(shí)驗室已成功預(yù)測大豆球蛋白G5亞基中酸性A3亞基的抗原表位，并成功將A3亞基的3個重疊分段的基因載體克隆完成并保存。

本實(shí)驗通過完成A3亞基全長的載體克隆，并通過T7噬菌體展示技術(shù)表達(dá)A3亞基及其3個片段的蛋白[23]，用間接競爭ELISA法檢測目的蛋白破壞抗原表位，為后續(xù)精確定位G5亞基中A3酸性肽鏈的致敏表位的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

質(zhì)粒提取試劑盒；DNA回收試劑盒；A3亞基以及3個重疊分段片段 A, B, C 的上下游引物；E. coli JM109 Competent Cells； pMDTM 18-T vector Cloning Kit；DNA Marker； Ribonuclease A；Recombinant DNase Ⅰ；T4 DNA Ligase；QuickCutTMEcoRⅠ；QuickCutTMHind Ⅲ；EX TaqTMVersion 2.0；噬菌體試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

nexus GSX1 PCR儀，Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)，D3024R離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 大豆球蛋白A3亞基氨基酸序列

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索大豆球蛋白A3亞基的氨基酸序列：

ITSSKFNECQLNNLNALEPDHRVESEGGLIETWN- SQHPELQCAGVTVSKRTLNRNGLHLPSYSPYPQMIIV- VQGKGAIGFAFPGCPETFEKPQQQSSRRGSRSQQQLQ- DSHQKIRHFNEGDVLVIPPGVPYWTYNTGDEPVVAIS- LLDTSNFNNQLDQNPRVFYLAGNPDIEHPETMQQQQ- QQKSHGGRKQGQHQQQEEEGGSVLSGFSKHFLAQSF- NTNEDTAEKLRSPDDERKQIVTVEGGLSVISPKWQEQ- EDEDEDEDEEYEQTPSYPPRRPSHGKHEDDEDEDEE- EDQPRPDHPPQRPSRPEQQEPRGRGCQTRN。

1.3.2 大豆球蛋白A3亞基抗原表位的預(yù)測

采用DNAstar，SOPMA，DiscoTope 2.0等預(yù)測11S球蛋白G5亞基中酸性A3亞基的B細(xì)胞抗原表位。

1.3.3 A3亞基的重疊分段及引物設(shè)計

根據(jù)預(yù)測出的抗原表位，在不打斷抗原表位的情況下將A3亞基進(jìn)行重疊式分段，每一段序列與前段序列重疊的氨基酸殘基數(shù)目為60個，使用Primer Premier 5軟件檢測模板中不含有 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ位點(diǎn)，設(shè)計引物結(jié)構(gòu)為5′-保護(hù)堿基-酶切位點(diǎn)-引物序列-3′，上游引物的限制性內(nèi)切酶為EcoR Ⅰ，下游的限制性內(nèi)切酶為Hind Ⅲ。

1.3.4 A3亞基的PCR擴(kuò)增及其克隆載體的構(gòu)建

A3亞基的3段分段基因的載體構(gòu)建以由實(shí)驗室完成并保存，現(xiàn)只需做全長基因的擴(kuò)增及其克隆載體的構(gòu)建。

1.3.4.1 A3亞基全長的基因擴(kuò)增

根據(jù)大豆球蛋白A3亞基全長的堿基序列，用PCR擴(kuò)增目的基因。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s,變性、退火和延伸這3個條件循環(huán)34次；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存，用2%的瓊脂糖電泳檢測PCR基因產(chǎn)物。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.3.4.2 A3基因的回收

用DNA回收試劑盒將基因收回并保存于-20 ℃?zhèn)溆?，具體參照試劑盒的操作步驟。

1.3.4.3 連接與轉(zhuǎn)化

連接體系(10 μL)：pMDTM-18T 載體：1 μL，DNA：4 μL，Ligation buffer：5 μL，將此體系置于16 ℃恒溫箱連接過夜。

轉(zhuǎn)化：將10 μL連接產(chǎn)物與25 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，置于冰上冷卻5 min后加入500 μL SOC Medium混勻，于37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h。將培養(yǎng)液在4 000 r/min下離心4 min，吸取 400 μL上清液棄之，將剩余溶液吹打混勻涂布于含Amp+(50 μg/mL)、IPTG(50 mg/mL)和X-gal(20 mg/mL)的固體培養(yǎng)基上，待凝固完全，在37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～16 h，直至形成肉眼可見的藍(lán)白斑。

1.3.4.4 白斑鑒定與基因酶切

挑取固體培養(yǎng)基上的單個白斑，溶解于20 μL TE中，水浴鍋65 ℃加熱10 min離心取上清，PCR鑒定重組質(zhì)粒，再挑去白斑接種于含25 μg/mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)10～12 h，7 000 r/min離心10 min取沉淀。用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒(具體參照試劑盒操作步驟)，并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定。

表2 PCR鑒定體系

PCR反映程序同1.3.4.1所述。

表3 雙酶切鑒定體系

將該體系在37 ℃水浴鍋中混勻50 min，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析并且用DNA回收試劑盒將基因收回并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 噬菌體包裝及鑒定

1.3.5.1 噬菌體包裝

將回收純化后的基因與噬菌體 vector arms連接，體系見表4。

表4 噬菌體包裝體系

將此體系混勻之后置于16 ℃恒溫孵育12～16 h，然后在連接產(chǎn)物中加入5倍體積的T7包裝提取物并混勻，置于22 ℃恒溫孵育2 h，加入9倍體積的LB液體培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

1.3.5.2 重組噬菌體的滴度測定

將大腸桿菌BLT5615加入8 mL 含有Carb+和IPTG的M9LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8。用LB培養(yǎng)基對重組噬菌體進(jìn)行103、104、105倍的梯度稀釋，取不同稀釋度重組噬菌體100 μL與5 mL預(yù)熱的Top agarose和250 μL BLT5615混合均勻鋪在含Carb+的固體培養(yǎng)基上，靜置30 min，在37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4 h后觀察噬菌斑，計算噬菌斑滴度(PFV)。

式中：X為噬菌斑數(shù)目；Y為對應(yīng)的噬菌體稀釋倍數(shù)。

1.3.5.3 重組噬菌體的PCR鑒定

挑選一個噬菌斑溶解于30 μL TE中[21]，65 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心1 min取上清，做PCR鑒定。

表5 PCR鑒定體系

重組噬菌體PCR體系：80 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，變性、退火和延伸這3個條件進(jìn)行35個循環(huán)；再延伸6 min；4 ℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因片段。

1.3.6 重組噬菌體的擴(kuò)大培養(yǎng)與保存

將BLT5615接種于8 mL含carb+的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，將1 mL培養(yǎng)過夜的菌液加入46 mL含carb+和IPTG的M9LB中誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，取10 μL的重組噬菌體接種于菌液中，37 ℃培養(yǎng)至菌液澄清為止，期間大約4 h，然后將噬菌體裂解物于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液以噬菌體：氯仿=15∶1的比例加入37 μL氯仿置于-80 ℃保存。

1.3.7 重組噬菌體的純化

室溫下向噬菌體的裂解物中加入固體PEG8000至終濃度為10%，以及終濃度為1 mol/L的NaCl，緩慢攪拌至溶解完全，冰浴1 h以上或者4 ℃過夜用以沉淀噬菌體顆粒，將冰浴后的溶液緩慢置于離心機(jī)，4 ℃，10 000 r/min離心10 min收集噬菌體顆粒。取500 μL無菌SM溶液重懸噬菌體顆粒，緩慢轉(zhuǎn)移至離心管，22 ℃孵育1 h后加入625 μL氯仿抽提懸濁液中殘留的細(xì)胞碎片和PEG8000，輕輕震蕩30 s后，4 ℃，5 000～6 000 r/min離心10 min分離水相，水相即為純化富集的噬菌體。

1.3.8 大豆球蛋白兔源多抗效價測定

經(jīng)硫酸銨純化后的濃度為32.587 mg/mL的大豆球蛋白兔抗由實(shí)驗室姚利利制備[22]。

用CBS溶液將重組噬菌體蛋白溶液稀釋至50 μg/mL，包被于96孔的ELISA板，每孔加入100 μL，設(shè)置3組平行，同時設(shè)置陰性和空白對照(包被用CBS)，放置4 ℃過夜；方法參考文獻(xiàn)[21]。

1.3.9 加工破壞抗原表位特異性抗體的制備

參考文獻(xiàn)[22]中熱加工處理大豆球蛋白抗原最佳條件為蛋白濃度10 mg/mL、110 ℃、50 min；超高壓聯(lián)合熱加工處理[24]抗原最佳條件為10 mg/mL，先超高壓400 MPa加工15 min，然后130 ℃熱處理20 min，抗原抑制率由87%降至37%。

將處理后的抗原與經(jīng)過400倍稀釋的兔抗分別加1 mL混勻，37 ℃孵育2 h之后，6 000 r/min離心1 min取上清，上清即為熱處理和超高壓聯(lián)合熱加工處理破壞抗原表位特異性抗體。

1.3.10 重組噬菌體的抗原性檢測

取用CBS溶液將噬菌體表達(dá)出來的蛋白溶液稀釋至50 μg/mL，然后包被96孔的ELISA板，每孔加入100 μL，同時設(shè)置陰性對照和空白對照(包被用CBS)，4 ℃過夜，拍板方法參考文獻(xiàn)[21]。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆球蛋白A3亞基的抗原表位預(yù)測

采用生物學(xué)信息軟件預(yù)測出A3亞基的主要線性表位區(qū)域為：90FEK-LQD109，169PDI171，174PETMQQ179，181QQQ-EEE200，230PDDERK235，249PKW251。

2.2 大豆球蛋白A3亞基的重疊分段(劃線部分為重疊片段)

第1段(1 ～ 140AA)：

ITSSKFNECQLNNLNALEPDHRVESEGGLIETWN- SQHPELQCAGVTVSKRTLNRNGLHLPSYSPYPQMIIVV- QGKGAIGFAFPGCPETFEKPQQQSSRRGSRSQQQLQD- SHQKIRHFNEGDVLVIPPGVPYWTYNTGDEP

第2段(81 ～230AA)：

保密性是無線通信網(wǎng)絡(luò)信息安全防護(hù)的主要方式。無線通信網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的保密性業(yè)務(wù)主要包括語音與數(shù)據(jù)保密性、用戶身份與位置保密、用戶和網(wǎng)絡(luò)間信息保密性等。采用保密性方式之后，除了信息的參與者之外，其他人即使截獲了信息也不能破解其中的含義。

AFPGCPETFEKPQQQSSRRGSRSQQQLQDSHQKI- RHFNEGDVLVIPPGVPYWTYNTGDEPVVAISLLDTSN- FNNQLDQNPRVFYLAGNPDIEHPETMQQQQQQKSHG- GRKQGQHQQQEEEGGSVLSGFSKHFLAQSFNTNEDT- AEKLRSP

第3段(171 ～320AA)：

IEHPETMQQQQQQKSHGGRKQGQHQQQEEEGG- SVLSGFSKHFLAQSFNTNEDTAEKLRSPDDERKQIVTV- EGGLSVISPKWQEQEDEDEDEDEEYEQTPSYPPRRPS- HGKHEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRPSRPEQQEPRG- RGCQTRN

2.3 A3亞基分段引物的設(shè)計

大豆球蛋白A3亞基基因分段引物設(shè)計如表6所示。

表6 大豆球蛋白A3亞基基因分段引物

2.4 A3亞基的PCR擴(kuò)增及其克隆載體的構(gòu)建

2.4.1 A3亞基全長的基因擴(kuò)增

以上海生工合成的載體質(zhì)粒為模板，采用PCR技術(shù)得到A3基因，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，觀察到的目的條帶與預(yù)期片段大小相符，且沒有非特異性擴(kuò)增，說明引物的特異性好。

注：M為DNA Marker Ⅲ；A3為全長。余同。圖1 總長PCR擴(kuò)增

2.4.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定和酶切鑒定

構(gòu)建基因克隆并成功的轉(zhuǎn)化到E.coli JM109 Competent Cells中，挑取白色菌落用TE加熱溶解并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示，觀察發(fā)現(xiàn)A3片段的長度與目的條帶相符，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

將挑取的白色菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，上方條帶為細(xì)菌的環(huán)狀質(zhì)粒，經(jīng)過酶切后，環(huán)狀質(zhì)粒的長度與pMD18-vector 載體的長度相當(dāng)且大于目的條帶，下方條帶大小為960 bp，與目的條帶大小相符，驗證了酶切成功。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.5 噬菌體包裝與鑒定

2.5.1 噬菌斑滴度測定

A3全長及其分段基因經(jīng)酶切后與T7 vertor arms進(jìn)行連接，加入包裝提取物并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BLT5615，4 h后形成噬菌斑，如圖4所示，通過計算得到A3基因及其A片段、B片段、C片段的重組噬菌體滴度分別為：6×106、1×106、5×105、1×105pfu。

圖4 重組噬菌體噬菌斑

2.5.2 重組噬菌體的PCR鑒定

挑選噬菌斑用TE溶解，65 ℃加熱10 min，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2%瓊脂糖電泳得到的結(jié)果如圖5所示，電泳條帶與目的條帶大小相一致。

注：1～3分別為片段A、片段B、片段C。圖5 重組噬菌體的PCR鑒定

2.6 加工破壞抗原表位的抗原性檢測

2.6.1 大豆球蛋白兔抗效價的測定

不同稀釋倍數(shù)的抗體與抗原反應(yīng)的吸光度值如圖6所示，隨著稀釋倍數(shù)的增加，OD450值逐漸降低，A3亞基的3個片段抗原性最高的是片段1、片段2和片段3的抗原性相差不大。

注：a-h為:差異性分析。圖6 大豆球蛋白兔抗效價測定

OD450值為1～1.5時，抗體能跟抗原有效結(jié)合，因此在1～1.5區(qū)間內(nèi)取抗體的最佳稀釋倍數(shù)，如果OD450>2或者OD450<1時，會超出抗原抗體的線性結(jié)合范圍，導(dǎo)致測得的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，影響實(shí)驗結(jié)果，而且低稀釋倍數(shù)在制作熱吸收抗體時需添加濃度過高的大豆球蛋白，蛋白會過多聚集形成網(wǎng)狀膜，使得抗原抗體不能完全反映，影響熱吸收抗體與目的蛋白結(jié)合。因此，兔抗經(jīng)過800倍稀釋時的效果最好。

2.6.2 加工破壞抗原區(qū)域的ELISA鑒定

間接競爭ELISA結(jié)果如圖7所示，片段1的抗原性最高，片段2和片段3的抗原性相差不大，片段上的表位越多就會結(jié)合更多的抗體，結(jié)果顯示的抗原性就高。從加工方式來看，不同的加工方法對蛋白的破壞程度也有一定差異，加工破壞的程度高，則抗體與破壞后的蛋白結(jié)合的表位變少，熱吸收抗體會與包被的目的蛋白上的表位結(jié)合，HRP會標(biāo)記結(jié)合目的蛋白的抗體，并與TMB發(fā)生顯色反映，結(jié)果顯示OD450值越高，抗原性就越強(qiáng)，反之則低。圖7顯示，超高壓聯(lián)合熱處理的方法對蛋白的破壞程度顯著，其中對片段1的破壞最強(qiáng)，說明此處理方法使大豆球蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊的含量降低，使得抗原表位減少；熱處理單獨(dú)作用的效果不顯著，蛋白本身的熱穩(wěn)定性高，而且在熱處理過程中，改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，在破壞抗原表位的同時，會造成新的無規(guī)則卷曲，有可能出現(xiàn)新的抗原位點(diǎn)。因此，片段1的抗原性最強(qiáng)，且超高壓聯(lián)合熱處理的方法對于片段1的破壞效果最顯著，下一步主要研究對于片段一的分段表達(dá)及被破壞抗原區(qū)域定位。

注：字母表示差異顯著。圖7 間接競爭ELISA結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗結(jié)果顯示，抗體與片段1結(jié)合最多，其抗原性最高，從加工破壞方式來看，超高壓聯(lián)合熱處理的方法對蛋白的破壞顯著性高，大大降低了蛋白中的致敏位點(diǎn)，而熱處理單獨(dú)作用的效果不顯著，可能是因為在加熱過程中沒有破壞掉隱蔽的位點(diǎn)或者又形成了新的無規(guī)則卷曲，2種方法都對片段1的破壞最強(qiáng)。

本研究通過成功構(gòu)建表達(dá)載體并定位加工破壞最顯著的抗原片段，實(shí)驗中用到的載體試劑盒和噬菌體試劑盒的連接轉(zhuǎn)化效率高，操作簡便，能有效表達(dá)出目的蛋白，后續(xù)可進(jìn)一步研究精確定位抗原表位，探究大豆球蛋白致敏性的分子機(jī)理等。