杜 杰， 林春蘭， 鄭繡蒨， 劉昌樹

(佳格投資(中國)有限公司，上海 201103)

維生素A(VA)和維生素E(VE)是一類脂溶性維生素[1]，VA中的視黃醇活性物質(zhì)和VE中的各生育酚可作為人體有益的功效成分[2]，維生素E具有人體抗氧化的功效[3]。其中最常見的4種維生素E有α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE[4]。VA不穩(wěn)定，常以酯化物的形態(tài)存在，市面上常用的功效添加劑為維生素A醋酸酯。有研究使用相同前處理同時檢測魚肝油中維生素A、D、E的方法[5]。GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測定》針對維生素A使用紫外檢測器，而維生素E使用熒光檢測器。前處理復(fù)雜，皂化提取需分開進樣且前分析時間冗長。也有學(xué)者對于前處理做快速檢測VA及VE并進行定量的方法[6]，但穩(wěn)定性差。本方法采用高效液相色譜法同時測定VA和VE，利用液相紫外檢測器的雙波長進行分析[8]，進一步優(yōu)化了液相色譜外標(biāo)法的前處理過程，同時對不同食用油中VA和VE進行測定，并通過方法驗證完善和確效分析方法的準(zhǔn)確性，節(jié)約操作時間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用植物油；無水乙醇(分析純)；丙酮(色譜純)；甲醇(色譜純)；二丁基羥基甲苯BHT(分析純)；α-VE CAS號10191-41-0，純度≥96%、 β-VE CAS號148-03-8，純度≥96%、 γ-VE CAS號54-28-4，純度≥96%、 δ-VE CAS號119-13-1，純度≥96%；VA醋酸酯CAS號127-47-9，純度≥95%。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9420A電熱鼓風(fēng)干燥箱，HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：KQ-300E超聲震蕩儀，TDL-5-A離心機，UV-1800紫外分光光度計，LC-VWD Agilent 1260高效液相色譜儀配紫外檢測器。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

VA醋酸酯母液配制：準(zhǔn)確稱取0.2 gVA醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%BHT甲醇溶液溶解后，轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中，定容至刻度，渦旋2 min，混勻，超聲3 min。此溶液中VA醋酸酯質(zhì)量濃度為20 mg/mL，在-20 ℃下避光保存，有效期180 d。

VA醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制：準(zhǔn)確吸取VA醋酸酯母液(20 mg/mL)0.1 mL于10 mL容量瓶中，用0.1%BHT甲醇定容至刻度，渦旋2 min，混勻，超聲3 min。此溶液中VA醋酸酯質(zhì)量濃度為200 μg/mL，在-20 ℃下避光保存，有效期15 d。

VE母液配制：分別準(zhǔn)確稱取α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE各100 mg，用無水乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL。將溶液分裝轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，在-20 ℃下避光保存有效期180 d。

VE標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 mg/mL)1 mL用無水乙醇溶解后，容量瓶中定容至10 mL，定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中在-20 ℃下避光保存，有效期15 d。

1.3.2 油脂樣品前處理

準(zhǔn)確稱取充分混勻的油樣2 g，精確到小數(shù)點后4位，于10 mL容量瓶中。用丙酮定容至10 mL，渦旋2 min，混勻，超聲振蕩3 min，過0.22 μm有機濾膜，HPLC分析。

1.3.3 高效液相色譜條件

HPLC：Agilent 1260；管柱：Athena C30，長度250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm；流速：0.8mL/min；進樣量：10 μL；柱溫20 ℃；紫外檢測器波長：325 nm和294 nm 雙波長；洗脫時間：30 min；流動相∶甲醇∶水，梯度洗脫時間見表1。

表1 不同時間的VA和VE標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 計算

式中：X為試樣中VA和VE的含量/μg/100 g；P為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的試樣中VA和VE的濃度/μg/mL；V為定容體積/mL；f為換算因子(VA醋酸酯:f=0.872；VE:f=1)；100為試樣中以每100 g計算的換算系數(shù)；m為試樣的稱樣量/g；a為實際濃度/校正濃度。

VE含量=α-VE含量+0.5β-VE含量+0.1γ-VE含量+0.01δ-VE含量。

1.3.5 濃度較正

取VA和VE標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，混勻，用1 cm石英比色皿，以無水乙醇為空白參比[8]，測定其吸光值，試液中VA和VE的濃度計算公式：

X=A×104/E

式中：X為VA和VE標(biāo)準(zhǔn)稀釋液質(zhì)量濃度/μg/mL；A為維生素稀釋液的平均紫外吸光值；104為換算系數(shù)；E為維生素1%比色光系數(shù)，各維生素在乙醇相應(yīng)的比色吸光系數(shù)見表2。

表2 各目標(biāo)物的波長以及比色光系數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)液相色譜紫外檢測器雙波長分析[9]，利用標(biāo)準(zhǔn)品儲備液(VA醋酸酯、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE)進行不同濃度下標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，不同時間的VA和VE標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

表3 不同時間的VA和VE標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 專一性、精密度和回收率

2.2.1 專一性(鑒別實驗)

HPLC分析VA和VE的含量，標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間在294 nm下32.12、29.49、28.80、26.07 min分別有α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等VE組分，并保留時間在325 nm下13.77 min，有VA醋酸酯組分出峰?？ㄗ延图坝衩子蚔A和VE的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品保持一致，VA醋酸酯高效液相色譜圖和VE生育酚高效液相色譜圖如圖1所示，儀器方法所需時間變化如圖2所示。

圖1 325 nmVA醋酸酯高效液相色譜圖

圖2 294 nmVE各組分高效液相色譜圖

使用同時測定儀器方法進行分析，可使分別測定的分析總時長從每一針65 min減少到40 min，大大節(jié)約了分析時間，提高了檢測的效率，見表4。

表4 同時檢測儀器方法的優(yōu)勢

2.2.2 樣品精密度

重復(fù)實驗樣品不同植物油進行分析(n=6)，VA含量葵花籽油平均735.58 μg/100 g，玉米油平均672.06 μg/100 g，組間VA含量RSD分別為0.84%和1.39%，VE含量以α-TE(α當(dāng)量)葵花籽油平均53.70 mg/100 g，玉米油平均25.52mg/100 g，組間VE含量RSD分別為2.01%和3.41%，綜合重復(fù)性實驗，結(jié)果顯示精密度良好，見表5～表11。本方法對VA和VE的分析具有良好的精密度和重復(fù)性。

表5 葵花籽油樣品精密度分析

表6 玉米油樣品精密度分析

表7 橄欖油樣品精密度分析

表8 大豆油樣品精密度分析

表9 菜籽油樣品精密度分析

表10 芝麻油樣品精密度分析

表11 花生油樣品精密度分析

2.2.3 樣品回收率

稱取樣品分別添加低、中、高3個加標(biāo)水平的標(biāo)準(zhǔn)品進行實驗，計算樣品含量與加標(biāo)后含量的偏差，回收率=(加標(biāo)后測定值-樣品本底值)/加標(biāo)量×100%。不同加標(biāo)水平的VA和VE回收率見表12，樣品中VA醋酸酯、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE回收率范圍分別為95.8%～104.4%、96.2%～101.9%、98.2%～107%、103%～112%、98.5%～101%，回收率范圍滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》。

表12 不同加標(biāo)水平的VA和VE回收率

2.2.4 檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

將樣品用丙酮配置成一系列濃度的溶液，按檢測方法制備、測定并進行含量分析，直至分析峰面積低于S/N范圍時，選擇前一樣品濃度，分析3次后確認(rèn)滿足檢出限和定量限范圍。計算色譜圖的S/N比。其中S為響應(yīng)信號值；N為噪聲值。S/N為3∶1的濃度為最低檢出限；S/N為10∶1的濃度為最低定量限，VA和VE的檢出限和定量限見表13。

表13 VA和VE的檢出限和定量限

2.3 油樣中VA和VE的檢測

利用本方法對不同植物油中VA和VE進行測定。對葵花籽油檢測結(jié)果可知，葵花籽油中檢測出α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等4種VE，其中α-VE含量最多，δ-VE未檢出?？ㄗ延蜆悠分蠽E(α-TE)的含量為(54.33±2.92)mg/100 g，葵花籽油中VA含量為(735.58±3.86)μg/100 g。玉米油的檢測結(jié)果顯示，玉米油中檢測出α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等4種VE含量，其中γ-VE含量最多，β-VE未檢出。玉米油中VE(α-TE)的含量為(24.78±1.36)mg/100 g，玉米油中VA含量為(676.75±2.15)μg/100 g，其他植物油含量見表14。

表14 不同植物油中VA和VE含量

3 結(jié)論

利用液相色譜法測定食用油中VA和VE，由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)VA醋酸酯以及VE的紫外吸收波長不同[10]，利用現(xiàn)代液相色譜儀器的優(yōu)勢，紫外檢測器雙波長的選擇，通過雙波長檢測同時測定了VA和VE的各組分。實現(xiàn)節(jié)約測試時間和同種樣品同步化處理[11]。實驗由標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，丙酮溶解油中維生素物質(zhì)，操作簡易。實驗表明，該方法的專一性強、VA的精密度RSD為0.84%～1.39%，回收率范圍在95.8%～104.4%；VE的各組分精密度RSD為2.01%～4.14%，回收率范圍在96.2%～112%。本方法也可應(yīng)用于測定食用油中VA和VE。測得葵花籽油VA含量(735.58±3.86)μg/100 g，VE的含量為(54.33±2.92)mg/100 g；玉米油VA含量(676.75±2.15)μg/100 g，VE的含量為(24.78±1.36)mg/100 g。通過實驗條件測定和方法驗證，建立了一個有效同時測定食用油中VA和VE的方法，該方法相較于標(biāo)準(zhǔn)方法更適用于食用油產(chǎn)品的測定，減少萃取和皂化多過程中對樣品維生素物質(zhì)的干擾，節(jié)約操作時間和溶劑。相較于分別利用液相色譜法測定單一VA和VE進行2次處理2次上機，節(jié)約了成本，具有步驟簡單，重復(fù)性好精密度高等特點。該方法可以應(yīng)用于不同油脂中VA和VE的含量分析，提供優(yōu)質(zhì)功能性和營養(yǎng)化訴求的研究依托，為進一步提升油脂行業(yè)的檢驗檢測和健康廚房糧油趨勢提供了參考。