定坤丹口服液與傳統(tǒng)工藝水蜜丸對(duì)雌性去勢(shì)大鼠的作用及藥效對(duì)比研究

張潤(rùn)濤，李佳，高喬，節(jié)笑笑，劉聰，倪艷，康永?，張愛(ài)榮，趙惠淳

（1. 山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012；2. 山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司，山西 晉中 030800）

定坤丹由紅參、鹿茸、西紅花等藥物組成，具有滋補(bǔ)氣血、調(diào)經(jīng)舒郁的功效，主要用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)行腹痛、崩漏下血、赤白帶下、血暈血脫、產(chǎn)后諸虛和骨蒸潮熱等，被廣泛應(yīng)用于婦科疾病，如卵巢功能不全、月經(jīng)病、不孕癥和更年期綜合征等［1］。目前定坤丹產(chǎn)品主要有口服液、水蜜丸與大蜜丸3 種劑型，其中定坤丹口服液具有口感好、吸收快且起效迅速的優(yōu)點(diǎn)，而定坤丹水蜜丸則具有作用緩慢、藥效持久且容易保存的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制雌性去勢(shì)大鼠模型，使大鼠處于卵巢功能缺失狀態(tài)，從而引起大鼠雌激素分泌紊亂，以此來(lái)探究定坤丹口服液及定坤丹水蜜丸對(duì)卵巢功能的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)二者的藥效進(jìn)行對(duì)比。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SD 大鼠，SFP 級(jí)，200 只，體質(zhì)量180～200 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。大鼠飼養(yǎng)于清潔恒溫環(huán)境，平均溫度25 ℃，平均濕度37%，15～20 次/h 全新風(fēng)，12 h光照、12 h黑暗。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

定坤丹口服液（山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司，批號(hào)：4112011002）；定坤丹水蜜丸（山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司，批號(hào)：3282011096）；補(bǔ)佳樂(lè)戊酸雌二醇片（Bayer，批號(hào)：583A）。

大鼠孕酮（P）ELISA試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠雌二醇（E2）ELISA試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠促卵泡刺激素（FSH）ELISA試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠黃體生成素（LH）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠前列腺素F2α（PGF2α）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；C5微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰）。

2 方法

2.1 分組與去勢(shì)大鼠模型的建立

全部大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、定坤丹水蜜丸組（水蜜丸組）以及定坤丹口服液高劑量組（高劑量組）、定坤丹口服液中劑量組（中劑量組）、定坤丹口服液低劑量組（低劑量組）。雌性大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，仰臥位固定于大鼠板上，剃毛消毒后，沿腹部正中線(xiàn)距陰道口2.5 cm 處切開(kāi)，使用剪刀在正中定位處打開(kāi)約1.5～2 cm 的皮膚切口。除空白組外，其余大鼠分離兩側(cè)輸卵管進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎后完整摘除兩側(cè)卵巢，分兩層縫合切口，用無(wú)菌生理鹽水沖洗傷口，碘伏消毒；空白組大鼠僅切開(kāi)，不結(jié)扎。術(shù)后連續(xù)3 d 各組大鼠腹腔內(nèi)注射青霉素4 萬(wàn)IU/d 以預(yù)防感染，6 d 后拆線(xiàn)，結(jié)扎術(shù)后大鼠可正常存活即為去勢(shì)大鼠模型復(fù)制成功。

2.2 分組給藥

術(shù)后1 周開(kāi)始灌胃給藥，按人與大鼠體表面積換算系數(shù)確定給藥劑量。高、中、低劑量組分別灌胃定坤丹口服液10、5、2.5 mL/kg，陽(yáng)性對(duì)照組予補(bǔ)佳樂(lè)0.12 mg/kg，水蜜丸組給予定坤丹水蜜丸1.75 g/kg，空白組和模型組大鼠灌服等劑量蒸餾水，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。每周稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，調(diào)整給藥劑量。

2.3 標(biāo)本采集

末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛溶液麻醉后進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈取血，一部分放入抗凝管中測(cè)定凝血功能，另一部分放入EP管中室溫靜置2 h后3 000 r/min離心20 min，取上清，制備血清，-20 ℃保存。摘取大鼠子宮，并稱(chēng)取子宮的質(zhì)量，計(jì)算子宮指數(shù)。子宮組織用生理鹽水沖洗后，立刻置于10%甲醛中固定。

子宮指數(shù)=子宮質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%

2.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中FSH、LH、E2、P、PGE2、PGF2α含量

嚴(yán)格根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)大鼠血清中FSH、LH、E2、P、PGE2和PGF2α的含量。

2.5 HE染色觀察大鼠子宮組織病理變化

生理鹽水沖洗后，立刻將子宮置于10%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，200 倍光鏡下觀察子宮內(nèi)膜損傷等病理形態(tài)學(xué)的變化情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間的多重比較采用LSD 分析，若方差不齊則采用Dunnett's T3多重比較法進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)及子宮指數(shù)比較

造模期間，空白組大鼠皮毛光滑，攝食、飲水規(guī)律，體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)；模型組大鼠毛發(fā)暗淡無(wú)光澤，情緒易激惹，體質(zhì)量較空白組明顯增加（P＜0.01）。給藥后，與模型組相比，中劑量組大鼠體質(zhì)量繼續(xù)增加（P＜0.01），水蜜丸組大鼠體質(zhì)量有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；定坤丹口服液各劑量組與水蜜丸組大鼠相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大鼠子宮指數(shù)較空白組明顯降低（P＜0.01）；定坤丹口服液各劑量組、水蜜丸組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠子宮指數(shù)較模型組顯著升高（P＜0.01）；中、低劑量組與水蜜丸組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠子宮指數(shù)及體質(zhì)量比較（xˉ±s，n=10）

3.2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較

模型組大鼠PT、TT較空白組顯著升高（P＜0.01）；高劑量組大鼠PT值較模型組降低（P＜0.05），高、中劑量組及水蜜丸組的TT值較模型組顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；定坤丹口服液各劑量組與水蜜丸組大鼠PT及TT值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較（xˉ±s，n=10）

3.3 各組大鼠性激素指標(biāo)比較

與空白組相比，模型組大鼠血清P、E2、PGE2 水平顯著降低，F(xiàn)SH、LH、PGF2α 水平顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，定坤丹口服液各劑量組、水蜜丸組大鼠血清P、E2、PGF2α 水平均不同程度升高，LH、FSH、PGE2 水平均不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），其中中劑量組大鼠的FSH 水平以及高、中劑量組大鼠的PGE2 水平較水蜜丸組改變更明顯（P＜0.05），其余指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠性激素指標(biāo)比較（xˉ±s，n=10）

3.4 各組大鼠子宮病理形態(tài)的比較

與空白組比較，模型組大鼠子宮明顯萎縮，內(nèi)膜上皮及子宮腺上皮細(xì)胞呈小圓柱狀，質(zhì)核比下降，子宮內(nèi)膜層變薄，間質(zhì)細(xì)胞呈紡錘形，細(xì)胞變小，肌層萎縮變薄；與模型組相比，各給藥組大鼠子宮均有不同程度的萎縮，水蜜丸組及定坤丹口服液高劑量組子宮萎縮情況減輕，間質(zhì)細(xì)胞排列密集，兩者相比無(wú)顯著差異。見(jiàn)圖1。

圖1 去勢(shì)模型大鼠子宮病理（HE，×200）

4 討論

定坤丹始于清乾隆年間，為宮廷秘方，乾隆帝因其可“安定坤富”而將其命名為“定坤丹”。該方由紅參、鹿茸、西紅花等中藥組成，由四君子湯、四物湯、逍遙散、八珍益母丸、理中丸、柴胡疏肝散等經(jīng)典名方化裁而成，具有共行補(bǔ)益氣血、滋補(bǔ)肝腎、調(diào)經(jīng)舒郁、健脾行氣、溫中祛寒、活血止痛之功效，用于治療氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、行經(jīng)腹痛、崩漏下血、赤白帶下、血暈血脫、產(chǎn)后諸虛和骨蒸潮熱等。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，定坤丹在原發(fā)性卵巢功能不全（POI）的治療中具有良好的效果［2-3］。POI 的發(fā)病原因包括遺傳學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)源性、環(huán)境和生活方式等因素［4］。LH、FSH、E2、P作為女性卵巢功能不全的早期標(biāo)志物，在疾病的發(fā)生過(guò)程中可表現(xiàn)為L(zhǎng)H、FSH 含量升高，E2、P含量降低，其中FSH 最為敏感［5］。女性的卵泡發(fā)育、性激素水平的調(diào)節(jié)以及正常生殖功能的維持主要依靠下丘腦-垂體-卵巢軸，E2、FSH 和LH 是女性生殖軸的重要激素［6］，其中E2受LH 和FSH 的調(diào)節(jié)，共同維護(hù)女性生殖系統(tǒng)正常的生理功能［7］。有研究表明，前列腺素與子宮收縮有密切關(guān)系，其中研究較多的是PGF2α 和PGE2，PGF2α 可促進(jìn)子宮收縮，而PGE2則對(duì)子宮收縮產(chǎn)生抑制作用［8-9］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)摘除大鼠卵巢復(fù)制雌性去勢(shì)大鼠模型，使大鼠處于卵巢功能缺失的狀態(tài)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行定坤丹口服液與定坤丹水蜜丸的藥效對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，定坤丹口服液和水蜜丸均能不同程度升高大鼠血清P、E2、PGE2 水平，降低LH、FSH、PGF2α 水平，證明定坤丹能夠通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠雌激素紊亂的狀態(tài)從而促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù)，另外給藥后TT降低也說(shuō)明出定坤丹能夠促進(jìn)凝血功能的改善。

水蜜丸是指藥材細(xì)粉以水和蜂蜜按適當(dāng)比例混勻?yàn)轲ず蟿┲瞥傻乃幫?，其作用緩慢，藥效持久，?yōu)點(diǎn)在于使用的蜂蜜量較少，含水量低，可便于長(zhǎng)期保存和服用?？诜簞┦且灾兴帨珓榛A(chǔ)，提取中藥內(nèi)的有效成分，并按照注射劑的加工工藝合成的口服液體制劑，具有服用劑量小、味道好、吸收快、奏效迅速和質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)定坤丹口服液和水蜜丸進(jìn)行藥效學(xué)對(duì)比，結(jié)果顯示二者具有相似的治療效果，因此可以在不同的應(yīng)用場(chǎng)景根據(jù)使用人群的偏好進(jìn)行選擇。