MALAT1對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠STAT3信號(hào)通路的影響

姚 瑤，劉 艷，胡 飛

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是復(fù)雜的慢性疼痛病癥，由感染、腫瘤、自身免疫等因素引起的外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及功能障礙所導(dǎo)致，主要臨床表現(xiàn)為炎癥區(qū)域持續(xù)性的自發(fā)痛、痛覺過敏和痛覺超敏，常見于脊髓損傷、皰疹病毒感染、癌癥化療及糖尿病病人，嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量[1-2]。目前，NP患病率為6.9%～10.0%，臨床藥物干預(yù)及物理治療均效果欠佳，是臨床較為難治的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀之一[3]。而NP的發(fā)生機(jī)制尚未明確，深入探討其機(jī)制將有助于尋求有效的臨床鎮(zhèn)痛方案。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在誘發(fā)NP的初級(jí)損傷、次級(jí)損傷過程中起重要作用，其調(diào)控成為NP治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是連接炎癥反應(yīng)與癌癥的關(guān)鍵信號(hào)通路分子，參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3通路在NP的炎癥反應(yīng)調(diào)控中扮演重要角色[7]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是被證實(shí)與非小細(xì)胞肺癌有關(guān)的第一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，可強(qiáng)化STAT3信號(hào)通路，在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8-9]，但在NP中的作用機(jī)制尚缺乏研究。本研究探討MALAT1對(duì)NP大鼠及STAT3信號(hào)通路的影響，以期為NP臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量210～250 g，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0004。飼養(yǎng)條件：晝夜交替(周期為12 h)，自由飲水、進(jìn)食，溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%。

1.1.2 主要試劑 MALAT1的慢病毒干擾載體由武漢益普生物科技有限公司構(gòu)建；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：WLA088b)購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：F-430)購(gòu)自北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司；MALAT1、STAT3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海信帆生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)試劑盒、RIPA裂解液(貨號(hào)：SBJ-R0064、SBJ-R0040、SBJ-R0546、SBJ-0995)購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；磷酸化STAT3(p-STAT3)、STAT3抗體、GAPDH抗體、羊抗兔免疫球蛋白G(貨號(hào)：ab76315、ab68153、ab181602、ab133470)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 2390型Electronic Von Fery觸覺測(cè)痛儀購(gòu)自美國(guó)CST公司；Lightcycler 480 Ⅱ型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀購(gòu)自德國(guó)Roche公司；MODEL550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；AlphaImager Mini型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，進(jìn)行鞘內(nèi)置管手術(shù)，置管后觀察3 d，選取置管成功的大鼠40只，分為對(duì)照組、假手術(shù)組、NP組、陰性慢病毒組和MALAT1 shRNA組，每組8只。NP組、陰性慢病毒組和MALAT1 shRNA組大鼠建立NP模型[3]：使用1%戊巴比妥鈉對(duì)大鼠(按0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉，左大腿剪毛，乙醇消毒，切開皮膚，暴露出坐骨神經(jīng)分支，用4-0絲線結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)(松緊適中，以不影響神經(jīng)血液循環(huán)、大鼠左后肢微微抽搐為宜)，該過程注意避免損傷其他神經(jīng)，傷口處撒青霉素粉末預(yù)防感染，依次縫合肌肉、皮膚；假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)，不進(jìn)行結(jié)扎，其他手術(shù)操作同上；對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)。術(shù)后MALAT1 shRNA組大鼠鞘內(nèi)注射30 μL MALAT1慢病毒干擾載體pLenti-CMV-MALAT1-RFP-Puro(1×109U/mL)，陰性慢病毒組注射等量陰性慢病毒干擾載體，對(duì)照組、假手術(shù)組、NP組注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠行為學(xué)測(cè)定 于造模前1 d及造模后1 d、7 d、14 d分別采用Von-Frey纖維法、熱輻射法測(cè)定大鼠的機(jī)械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，以評(píng)價(jià)大鼠機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏。MWT測(cè)定：將大鼠放在透明玻璃籠中(底部為1 cm×1 cm的鐵絲網(wǎng))，用不同力度值的Von-Frey纖維絲刺激大鼠左后足掌心，直至出現(xiàn)縮足、舔足等動(dòng)作即為陽(yáng)性，記錄力度為痛閾值，初始力度為2 g，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則降低力度繼續(xù)刺激，反之提升力度繼續(xù)刺激，重復(fù)5次，每次間隔5 min，至少出現(xiàn)3次抬足反應(yīng)的痛閾值記為MWT。TWL測(cè)定：將大鼠放在透明玻璃籠中(底部為1 cm×1 cm的鐵絲網(wǎng))，用熱痛刺激儀照射大鼠左后足掌心，記錄照射開始至大鼠縮足間的時(shí)間，即TWL，均重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔5 min，取均值。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)情況 造模后14 d，將大鼠斷頭處死，取脊髓組織，取部分于冰上勻漿，RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，使用qRT-PCR試劑盒配制反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀上檢測(cè)MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法表示結(jié)果。MALAT1正向引物：5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，反向引物：5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；STAT3正向引物：5′-ATGAGTGTGGCCGTTGCA-3′，反向引物：5′-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物：5′-CCAGGGCTGCCTTCTCTTGT-3′，反向引物：5′-GTGCCGTTGAACTTGCCGTG-3′。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)大鼠脊髓組織中炎癥相關(guān)因子表達(dá)情況 取部分脊髓組織于冰上勻漿，于4 ℃下，20 000×g離心30 min，分離上清液，使用IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)大鼠脊髓組織中STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 向剩余的脊髓組織加含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上勻漿，提取總蛋白，BCA法定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，脫脂奶粉封閉1 h，依次加一抗(p-STAT3、STAT3抗體、GAPDH抗體，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加二抗(羊抗兔免疫球蛋白G，1∶1 500)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，掃描圖像，分析目的蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 造模前1 d，各組大鼠MWT、TWL比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后1 d、7 d、14 d，對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠MWT、TWL比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，NP組MWT明顯降低(P<0.05)，TWL明顯縮短(P<0.05)；NP組MWT、TWL與陰性慢病毒組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠MWT明顯升高(P<0.05)，TWL明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠MWT、TWL比較(±s)

2.2 各組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)情況 對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，NP組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；NP組與陰性慢病毒組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

2.3 各組大鼠脊髓組織中炎癥相關(guān)因子表達(dá)情況 對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，NP組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；NP組與陰性慢病毒組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較(±s) 單位：pg/mg

2.4 各組大鼠脊髓組織中STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，NP組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；NP組與陰性慢病毒組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 各組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

NP是臨床常見疾病，病因、癥狀多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床尚缺乏有效根治的方法，且無(wú)法在人體中進(jìn)行模擬研究[10]。為進(jìn)一步闡明NP的發(fā)病作用機(jī)制并尋找緩解NP的方法，本研究采用坐骨神經(jīng)分支選擇性結(jié)扎法建立NP大鼠模型，造模后1 d，NP組大鼠較假手術(shù)組大鼠MWT明顯降低，TWL明顯縮短，即大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛覺過敏及熱痛覺過敏，表明模型制備成功。

慢性神經(jīng)性痛的發(fā)生發(fā)展是由多個(gè)因素相互影響的復(fù)雜過程，多重證據(jù)表明，炎癥通路中的炎癥介質(zhì)可充當(dāng)疼痛介質(zhì)，參與NP的病理過程[11]。坐骨神經(jīng)分支結(jié)扎損傷后引起局部組織炎癥反應(yīng)，通過釋放內(nèi)源性物質(zhì)將外周感受器活化，進(jìn)而將傷害性刺激傳入脊髓組織，導(dǎo)致脊髓組織釋放大量炎癥介質(zhì)及致痛因子，參與NP的發(fā)生發(fā)展[12]。本研究結(jié)果亦顯示，與假手術(shù)組比較，NP組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯升高，提示炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β參與NP的發(fā)生過程。STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要媒介，可被多種細(xì)胞因子激活，在炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。楊建梅等[15]研究顯示，復(fù)方藜芍片改善慢性偏頭痛的作用機(jī)制可能與阻斷大鼠皮層酪氨酸激酶2(JAK2)/STAT3通路，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)。周瑞等[16]研究表明，鞘內(nèi)注射MRS2211能明顯緩解糖尿病神經(jīng)痛大鼠熱痛敏癥狀，其作用機(jī)制與抑制脊髓背角IL-1β、IL-6表達(dá)，進(jìn)一步抑制JAK2/STAT3通路激活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，NP組大鼠脊髓組織中STAT3 mRNA水平及蛋白磷酸化水平均明顯升高，提示STAT3通路參與NP的病理進(jìn)程。MALAT1屬于lncRNA，既往在癌癥方面多有研究，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在多種炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8-9]。Wei等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1可通過miR-150-5p /核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)軸調(diào)節(jié)敗血癥誘導(dǎo)的心臟炎癥。Patel等[18]研究表明，創(chuàng)傷性腦損傷后，脂肪干細(xì)胞衍生的外泌體中的MALAT1能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕腦皮質(zhì)損傷。王悅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝損傷過程中，MALAT1的高表達(dá)與IL-6/STAT3信號(hào)通路激活有關(guān)。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1能通過上調(diào)miR-20b-5p，進(jìn)而增強(qiáng)STAT3，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)展。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，NP組大鼠脊髓組織中MALAT1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，提示MALAT1的異常升高與NP發(fā)生機(jī)制有關(guān)。本研究通過鞘內(nèi)注射MALAT1慢病毒干擾載體下調(diào)MALAT1在大鼠中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大鼠MWT明顯升高，TWL明顯延長(zhǎng)，提示干擾MALAT1表達(dá)可緩解NP大鼠的機(jī)械痛覺過敏及熱痛覺過敏癥狀。同時(shí)，干擾MALAT1表達(dá)后，NP大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平及STAT3 mRNA、蛋白磷酸化水平均明顯降低，提示干擾MALAT1表達(dá)可抑制NP大鼠脊髓組織炎癥反應(yīng)并抑制STAT3信號(hào)通路激活。

綜上所述，MALAT1在NP大鼠體內(nèi)高表達(dá)，干擾其表達(dá)能抑制NP大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)及STAT3信號(hào)通路的激活，緩解機(jī)械痛覺過敏及熱痛覺過敏癥狀。