溫度調(diào)控線粒體自噬活性影響再灌注損傷合并膿毒癥大鼠心肌功能的實驗研究

陳辰博，趙吉銳，唐美秀，劉建和，，李 亮

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)現(xiàn)象在臨床較為常見，理論上缺血區(qū)域的血供可恢復，但引發(fā)的心肌缺血/再灌注損傷可繼發(fā)性導致急性心力衰竭、腦功能障礙、胃腸功能障礙、全身炎癥反應綜合征[1-2]。重者出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征，危及病人生命，因此，心肌缺血/再灌注損傷研究一直為基礎和臨床研究的熱點。心肌缺血/再灌注損傷伴發(fā)膿毒癥病人因全身炎性反應綜合征被激發(fā)，心臟發(fā)生不可逆的功能障礙且進行性加重，治療難度相對較大，采取科學、規(guī)范的方法維持再灌注能有效改善心肌功能，降低臨床病死率[3]。檢索國內(nèi)外研究，關于再灌注條件參數(shù)設置的研究相對較多，但關于再灌注溫度調(diào)控對心肌影響機制的論述偏少[4-5]。本研究探討溫度調(diào)控線粒體自噬活性，繼而影響心肌缺血/再灌注合并膿毒癥大鼠的內(nèi)在機制，為再灌注相關技術及條件設置提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量253～287 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證編號：SYXK湘2021-0003)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，晝/夜交替(均為12 h)，自由飲水和進食，適應性喂養(yǎng)7 d開始實驗。分為健康組(9只)和模型組(36只)，健康組正常飼養(yǎng)，模型組先后制作膿毒癥模型和心肌缺血模型。本動物實驗遵循相關規(guī)定，在長沙醫(yī)學院重點實驗室備案。

1.2 試劑儀器

1.2.1 主要試劑 丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)分析試劑盒[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；白細胞介素-1β(IL-1β)的酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)定量檢測試劑盒[Abcam 公司、沃卡威(北京)生物技術有限公司]；肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(上海喬羽生物科技有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)活力檢測試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)測定試劑盒(深圳市科潤達生物工程有限公司)；血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)和半胱天冬氨酸蛋白酶-2(Caspase-2)ELISA檢測試劑盒購自上海滬震生物科技有限公司；IκB激酶β(IKKβ)測定試劑盒(上海梵態(tài)生物科技有限公司)；Na+-K+-ATP酶ELISA試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)；大鼠三磷酸腺苷(ATP)ELISA試劑盒(上海臻科生物科技有限公司)；輔酶Q細胞色素C還原酶ELISA試劑盒[今品化學技術(上海)有限公司]；NADH-輔酶Q還原酶ELISA試劑盒[卡邁舒(上海)生物科技有限公司]；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法測定試劑盒[上海碧云天生物技術有限公司]等。

1.2.2 主要儀器 HH-s4型水浴鍋(濟南歐萊博科學儀器有限公司)；FA型電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)；BYG16型高速離心機(長沙湘銳離心機有限公司)；M401542型全自動生化檢測儀(北京普朗新技術有限公司)；JD-SY96S型酶標儀(山東競道光電科技有限公司生產(chǎn))；FKW型醫(yī)用控溫儀(南京貝登醫(yī)療股份有限公司)等。

1.3 造模方法 先制作膿毒癥模型，而后制作心肌缺血模型，造模過程中2只大鼠意外死亡通過遞補機制進行補充。

1.3.1 膿毒癥造模方法 大鼠腹腔注射脂多糖10 mg/kg，每天3次。12 h內(nèi)出現(xiàn)蜷縮、少動、倦怠、少食、腹瀉、眼角滲出內(nèi)容物等典型癥狀則造模成功[6]。

1.3.2 心肌缺血造模方法 禁食10 h，固定于手術臺上并連接生物功能實驗系統(tǒng)，腹腔注射4%戊巴比妥鈉50 mL/kg進行麻醉，頸部備皮并用75%乙醇消毒。于頸部造2 cm切口，鈍性分離右側頸前肌和胸鎖乳突肌后暴露右側頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，手術線結扎頸總動脈近心端，血管夾對頸外動脈和頸內(nèi)動脈進行暫時性夾閉(關閉10 s，開放10 s，循環(huán)120 s)。大鼠心前區(qū)較其他未缺血心肌變灰白則造模成功[7]。

1.4 分組及干預方法

1.4.1 分組方法 采用隨機數(shù)字表將模型組大鼠分為低溫組、亞低溫組、常溫組、高溫組，每組9只。其中，低溫組再灌注溫度為(5±1)℃，亞低溫組再灌注溫度為(32±1)℃，常溫組再灌注溫度為(36±1)℃，高溫組再灌注溫度為(39±1)℃[8]。

1.4.2 再灌注操作 大鼠連接動物呼吸機，調(diào)整呼吸頻率為75次/min，呼吸比為1∶1，潮氣量為11.5 mL/100 g。用血管鉗剝離大鼠第三肋、第四肋間肌，再用開胸器擴張兩側肋骨，露出心臟。小心撕去心包膜，于左前降支緩慢進針，迅速結扎血管后出針，待缺血30 min剪開結扎，設置(5±1)℃、(32±1)℃、(36±1)℃、(39±1)℃的生理鹽水分別對4組大鼠進行再灌注30 min，密切關注大鼠生命體征情況[9-10]。

1.5 檢測指標

1.5.1 特征生化指標和特征蛋白 MDA、SOD、IL-1β、CK-MB、LDH、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)蛋白、AngⅠ蛋白、Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量參照各試劑盒說明書進行檢測。

1.5.2 心肌細胞線粒體呼吸鏈相關酶 ①心肌細胞線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測采取定磷法，通過無機磷在反應中的釋放量來測定心肌組織內(nèi)ATP含量(以單位時間內(nèi)每克蛋白釋放ATP所需的無機磷量表示)，按ATP酶檢測試劑盒說明書操作，酶標儀測定OD值[11]。②心肌細胞線粒體呼吸鏈酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性采用BCA法測定：預先調(diào)整各樣品蛋白濃度保持一致，按ELISA 試劑盒說明書操作，用酶標儀測定各孔OD值(λ=450 nm)，繪制標準曲線并按曲線方程計算結果[12]。

2 結 果

2.1 健康組和模型組大鼠心肌組織各指標含量比較 模型組大鼠MDA、IL-1β、CK-MB、Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量高于健康組，SOD、VEGFA蛋白、AngⅠ蛋白含量低于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、呼吸鏈酶Ⅰ、呼吸鏈酶Ⅱ、呼吸鏈酶Ⅲ含量低于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1～表3。

表1 健康組和模型組大鼠心肌組織特征生化指標含量比較(±s)

表2 健康組和模型組大鼠心肌組織特征蛋白含量比較(±s)

表3 健康組和模型組大鼠心肌細胞線粒體呼吸鏈相關酶含量比較(±s)

2.2 不同灌注溫度組大鼠心肌組織各指標含量比較 亞低溫組大鼠MDA、IL-1β、CK-MB、Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量低于低溫組、常溫組、高溫組，SOD、VEGFA、AngⅠ蛋白含量高于低溫組、常溫組、高溫組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；亞低溫組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、呼鏈酶Ⅰ、呼吸鏈酶Ⅱ含量高于低溫組、常溫組、高溫組，呼吸鏈酶Ⅲ含量低于低溫組、常溫組、高溫組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4～表6。

表4 不同灌注溫度組心肌組織特征生化指標含量比較(±s)

表5 不同灌注溫度組心肌組織特征蛋白含量比較(±s)

表6 不同灌注溫度組心肌細胞線粒體呼吸鏈相關酶含量比較(±s)

3 討 論

心肌缺血/再灌注是在多種疾病狀態(tài)下發(fā)生的病理事件，能導致有害的細胞損傷[13]。缺血是指器官的血液供應受限，其與細胞代謝失衡和有害缺氧有關。再灌注能夠恢復受影響缺血區(qū)域的血流和再充氧，這會進一步導致組織過度退化，引發(fā)破壞性炎癥反應[14-15]。心肌缺血/再灌注期間心肌膜完整性喪失，心肌酶CK-MB、LDH釋放到血液中。因此，血清CK-MB和LDH水平作為心肌組織損傷的指標[16]。本研究結果顯示，模型組MDA、CK-MB高于健康組，而SOD低于健康組(P<0.05)，證實心肌缺血/再灌注合并膿毒癥模型大鼠造模成功，其血清多項炎癥、應激指標的表達水平均有明顯改變。亞低溫組MDA、CK-MB、SOD表達水平均優(yōu)于其他組別，證實大鼠進行再灌注操作時保持適當?shù)蜏赜兄诰徑庑募〖毎植繎し磻??？赡芘c病態(tài)下大鼠不能適應絕對低、高溫而會繼發(fā)性損害原有損傷的心臟組織，常溫灌注則不會減緩內(nèi)毒素侵襲心肌組織有關[17-18]?？捎媒M織氧和營養(yǎng)物質(zhì)的突然減少是引發(fā)缺血組織細胞損傷的關鍵，在缺血條件下，線粒體從有氧代謝轉變?yōu)闊o氧代謝，隨后導致ATP減少并伴隨組織酸化，ATP生成的抑制引發(fā)細胞內(nèi)鈉和細胞外鉀水平的升高，從而使細胞去極化，并導致補償性瞬時鈣內(nèi)流[19]。同時，鈣依賴性蛋白水解酶被激活，導致細胞凋亡和壞死[20]。此外，在這種細胞級聯(lián)反應中，其他重要的ATP依賴性細胞功能，例如磷酸化和酶活性，也受到抑制，導致細胞應激和細胞死亡級聯(lián)反應，在正常的非缺血生理條件下，幾種內(nèi)源性機制負責清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)[21]。研究表明，缺血組織的再灌注會導致活性氧的“爆發(fā)”，而這種氧化爆發(fā)可以介導缺血/再灌注損傷[22]。還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶家族的線粒體呼吸鏈和NADPH氧化酶被認為是ROS的重要來源，內(nèi)源性或外源性抗氧化劑已被證明可以保護肝臟、腎臟、心臟和大腦免受缺血/再灌注損傷[23]。本研究結果顯示，模型組5種心肌細胞線粒體呼吸鏈相關酶含量均低于健康組，且亞低溫組大鼠各指標含量均高于其他溫度組，表明低溫對缺血心肌組織灌注具有保護作用，這可能是低溫生理鹽水能快速降低心肌溫度，減輕心肌組織損傷。線粒體通透性的特征在于相對不可滲透的線粒體內(nèi)膜的透化[23]。在再灌注期間，細胞的命運由線粒體透化程度決定，如果線粒體透化程度較小，則細胞可能會恢復；如果線粒體透化程度中等，細胞可能會經(jīng)歷程序性細胞死亡；如果線粒體透化程度嚴重，細胞可能會因能量產(chǎn)生不足而壞死[24]。

缺血和再灌注過程中的細胞內(nèi)變化，如H+和Ca2+的積累以及線粒體膜電位的破壞，導致自由基或活性氧的形成。產(chǎn)生的炎性小體包括不同的銜接分子，可介導IL-1β的產(chǎn)生和分泌增加[20-21]。研究表明，糖尿病心肌缺血/再灌注后，心肌的氧化應激因子SOD水平降低，而MDA水平升高，產(chǎn)生過多的活性氧，加劇了心肌損傷的發(fā)展[25]。在本研究中，模型組大鼠MDA、IL-1β含量明顯高于健康組大鼠，SOD含量明顯低于健康組大鼠(P<0.05)。亞低溫組大鼠MDA、IL-1β含量明顯低于其他溫度組大鼠，SOD含量明顯高于其他溫度組大鼠(P<0.05)，表明低溫處理可以減輕缺血再灌注損傷合并膿毒癥中的氧化應激程度。

膿毒癥最嚴重的臨床癥狀是感染性休克，表現(xiàn)為血管擴張和心肌功能障礙。膿毒癥心肌功能障礙的發(fā)生與死亡率密切相關[6，11]。研究表明，VEGFA和AngⅠ可通過調(diào)節(jié)細胞增殖、抑制細胞凋亡和減少氧自由基的釋放而對心肌缺血/再灌注發(fā)揮心臟保護作用[23]。Caspase-2在使線粒體透化和啟動促凋亡線粒體蛋白釋放方面具有明顯的上游作用[24]。IKKβ能夠介導核轉錄因子-κB(NF-κB)活化[25]。NF-κB信號通路是機體內(nèi)一條重要的炎性調(diào)節(jié)通路，在膿毒癥時處于激活狀態(tài)[26]。在本研究中，模型組大鼠VEGFA、AngⅠ蛋白含量明顯低于健康組大鼠，Caspase-2、IKKβ蛋白含量明顯高于健康組大鼠(P<0.05)，且亞低溫組大鼠VEGFA、AngⅠ蛋白含量明顯高于其他溫度組大鼠，Caspase-2蛋白、IKKβ蛋白含量明顯低于其他溫度組大鼠(P<0.05)，表明低溫處理可能對缺血再灌注損傷合并膿毒癥大鼠具有心臟保護作用。這可能是VEGFA通過促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移而直接作用于血管內(nèi)皮細胞。AngⅠ與腺嘌呤核苷酸轉運體結合，增加線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放閾值，從而抑制mPTP開放，保護線粒體膜的完整性[27]。

本研究動物為再灌注損傷合并膿毒癥大鼠，其病態(tài)能較好反映病癥復雜的臨床病人，通過與健康組比較也可深入了解疾病對其機能的嚴重影響；比較不同溫度灌注病態(tài)大鼠引發(fā)影響的差別，可為臨床實踐提供參考依據(jù)；分析溫度調(diào)控心肌細胞線粒體自噬活性，繼而影響心肌功能的內(nèi)在機制，可為再灌注手術操作的參數(shù)設定及后續(xù)探索積累一定理論基礎。但本研究尚未對信號通路、特定基因進行檢測，其機制探索仍相對局限，后續(xù)研究需在此基礎上加以完善。