慢性疲勞綜合征大鼠模型的行為學(xué)特征研究

徐小珊，田岳鳳，翟春濤，李 瑋

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)作為亞健康的一種重要表現(xiàn)形式，以不明原因的持續(xù)性疲勞(>6個(gè)月)為其主要臨床表現(xiàn)，并伴有多種其他系統(tǒng)癥狀如肌肉酸痛、食欲減退、睡眠障礙等，已成為困擾人類健康的主要問題之一，易發(fā)展為多種疾病的前期狀態(tài)，甚至進(jìn)一步危害認(rèn)知功能與精神狀態(tài)[1-2]。隨著時(shí)代的飛速發(fā)展與物質(zhì)生活的極大豐富，該病發(fā)病率逐年增加，給人們的生產(chǎn)水平、生活質(zhì)量都帶來了很大的負(fù)面影響[3-4]。調(diào)查結(jié)果表明，CFS總體患病率約為0.89%，女性患病率較高于男性，各年齡層與職業(yè)人群均出現(xiàn)不同程度的疲勞癥候群，但具體數(shù)值隨診斷方法與疾病定義波動(dòng)明顯[5-6]。

CFS現(xiàn)已成為21世紀(jì)臨床研究的熱點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制尚未清楚，認(rèn)為其與多系統(tǒng)功能異常相關(guān)，通過基因表達(dá)、能量代謝及免疫系統(tǒng)等方面研究來解釋CFS病人的臨床表現(xiàn)，尚無明確定論[7-9]。因此，構(gòu)建動(dòng)物模型來研究CFS發(fā)病機(jī)制對于臨床上更深入地認(rèn)識(shí)并治療CFS有著非常重要的意義。

目前，國內(nèi)外研究者主要選擇單一刺激或復(fù)合刺激等多種手段，通過強(qiáng)制力竭游泳、跑臺(tái)訓(xùn)練等體力消耗性方法進(jìn)行身體疲勞造模，采用慢性束縛、剝奪睡眠、不定時(shí)禁食等手段造成心理疲勞[10-11]，能夠兼顧軀體與心理兩方面的壓力，更好地模擬CFS致病因素與發(fā)病過程，但造模方法尚未規(guī)范統(tǒng)一。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[12-13]選擇力竭游泳與慢性束縛兩種干預(yù)措施進(jìn)行復(fù)合造模，造模期間觀察大鼠一般狀態(tài)、攝食量、體質(zhì)量變化情況，并選擇曠場試驗(yàn)與懸尾試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)，配合血清學(xué)與組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)，來觀察各組大鼠造模進(jìn)程中CFS疾病形成過程，檢測造模成功與否，并作為進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的主要憑證。大量文獻(xiàn)顯示，CFS多選擇每日束縛加力竭游泳的多因素造模方法，造模時(shí)間為14 d[14-15]。但課題組參照文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方案在造模過程中發(fā)現(xiàn)，造模14 d后，采用曠場實(shí)驗(yàn)與懸尾實(shí)驗(yàn)[16-17]證實(shí)模型尚未完全成功。因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程中，按照文獻(xiàn)造模方法并加以改進(jìn)，相對來說排除了如大鼠應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈等干擾因素，減少了不必要的實(shí)驗(yàn)誤差，并可以進(jìn)一步明確模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，使實(shí)驗(yàn)操作過程更規(guī)范，更貼合實(shí)驗(yàn)具體情況，為后續(xù)行為學(xué)檢測提供了較易復(fù)制的實(shí)驗(yàn)過程?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件 無特定病原體(SPF)級SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料均由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白組與模型組，每組15只。實(shí)驗(yàn)期間溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在30%～50%，鼠籠與水壺定時(shí)清洗并消毒，墊料及時(shí)更換，保證環(huán)境清潔與空氣流通。

1.1.2 主要儀器 電子天平：精度0.1 g，永康市永州衡器有限公司(產(chǎn)品型號(hào)：SF-400)；自制束縛筒：管狀自制塑料筒，長約20 cm，外直徑約6 cm，筒前段開一小直徑通氣口(直徑約3 cm)，后端為直接可開關(guān)閘門讓大鼠進(jìn)入，大鼠頭向通氣口進(jìn)入后關(guān)閉閘門，調(diào)整瓶身直徑為老鼠不能轉(zhuǎn)向且不過分壓迫的大??；自制大鼠PVC游泳箱，約為60 cm×50 cm×40 cm大??；懸尾測定儀：自制塑料懸掛鼠尾板，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司(ZH-YLS-181)；曠場實(shí)驗(yàn)儀器：成都泰盟軟件有限公司(OFT大小鼠開場活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng))；酶標(biāo)儀：上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司(型號(hào)：SM600)；生物顯微鏡：日本Olympus公司。

1.2 造模方法 將30只SPF級SD大鼠隨機(jī)分為空白組與模型組，對模型組進(jìn)行造模，上午采用力竭游泳，下午慢性束縛，共造模21 d。力竭游泳造模方法：使大鼠在自制游泳箱(長60 cm，寬50 cm，高40 cm，水深30 cm)內(nèi)進(jìn)行強(qiáng)制游泳，采用強(qiáng)迫手段使大鼠在水面上維持持續(xù)游泳狀態(tài)，靜止時(shí)長不能超過5 s。以大鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)，或頭部沉入水中10 s不能浮出水面為力竭標(biāo)準(zhǔn)。慢性束縛方法：將大鼠置于自制束縛筒內(nèi)(筒長20 cm，內(nèi)徑5.3 cm，外徑6.0 cm)，使其處于不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度，頭向通氣孔方向，注意觀察并記錄大鼠束縛狀態(tài)，每次束縛3 h。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般狀態(tài)觀察 造模期間，每日觀察大鼠的體型、毛色、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)以及每日飲水情況等一般狀態(tài)，同時(shí)對大鼠每日攝食量進(jìn)行測定，記錄變化。

1.3.2 體質(zhì)量的測定 每日進(jìn)行體質(zhì)量測定，比較造模過程中1 d、7 d、14 d、21 d兩組體質(zhì)量差異。

1.3.3 曠場實(shí)驗(yàn)情況變化 曠場實(shí)驗(yàn)主要用于評價(jià)在陌生環(huán)境中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自主探究行為以及緊張程度等情緒反應(yīng)，是在判斷CFS模型建立成功與否時(shí)對心理疲勞狀態(tài)觀察的一項(xiàng)重要行為學(xué)指標(biāo)。將大鼠放入曠場實(shí)驗(yàn)箱的正中格內(nèi)，觀察大鼠在一段時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)情況。測定指標(biāo)：①水平跨格數(shù)(3爪以上跨入臨格的次數(shù))；②站立次數(shù)(兩前肢完全離地并保持直立的次數(shù))；③運(yùn)動(dòng)距離(在各格間運(yùn)動(dòng)的距離總和)。在造模前后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行組間比較。

1.3.4 懸尾實(shí)驗(yàn)情況變化 懸尾實(shí)驗(yàn)主要用于反映造模后大鼠體力變化情況以及疲勞程度，能通過大鼠掙扎次數(shù)來充分體現(xiàn)大鼠體力下降水平，以及大鼠憤怒情緒下試圖改變不適狀況的強(qiáng)烈愿望，不動(dòng)時(shí)間則顯示出了大鼠因無可回避的壓迫環(huán)境產(chǎn)生的“行為絕望狀態(tài)”，與抑郁疾病表現(xiàn)相似，屬于判斷大鼠心理與身體雙重疲勞的一項(xiàng)有效行為學(xué)指標(biāo)。于造模各節(jié)點(diǎn)進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)并比較兩組間差異。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測血清免疫球蛋白及血乳酸變化 造模結(jié)束后對大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，置于含促凝劑的真空管中，靜置10 min后，以3 000 r/min離心，取上清液，采用ELISA檢測兩組大鼠血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、補(bǔ)體C3以及血乳酸的含量。

1.3.6 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察股四頭肌組織形態(tài)變化 造模結(jié)束后取大鼠雙側(cè)股四頭肌組織，生理鹽水清洗后吸干表面水分，后置于4%多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行HE染色，觀察兩組大鼠股四頭肌組織形態(tài)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模后大鼠出現(xiàn)飲水量減少以及不同程度的攝食量下降趨勢，但與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠毛發(fā)稀疏、光澤減退、體型明顯減小，出現(xiàn)煩躁多動(dòng)的表現(xiàn)，瞇眼明顯，精神較萎靡，喜歡扎堆。同時(shí)部分大鼠出現(xiàn)嗜睡、大便稀、逃避反應(yīng)能力明顯降低，出現(xiàn)好斗傾向，部分大鼠存在不同程度的耳部、尾部并下肢受傷，部分傷情明顯。詳見圖1。

圖1 兩組大鼠攝食量變化情況

2.2 兩組體質(zhì)量變化 兩組造模前(1 d)體質(zhì)量與造模后7d較1d的體質(zhì)量增加值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組造模后14 d、21 d較1 d的體質(zhì)量增加值低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

表1 兩組體質(zhì)量變化比較(±s) 單位：g

與空白組比較，＊P<0.05。圖2兩組大鼠體質(zhì)量增加情況(以1 d為基數(shù)計(jì)算體質(zhì)量增加值)

2.3 曠場實(shí)驗(yàn) 造模14 d，與空白組比較，模型組水平跨格數(shù)與站立次數(shù)雖均有所下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模21 d，模型組水平跨格數(shù)與站立次數(shù)較空白組均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組造模14 d和21 d運(yùn)動(dòng)距離與空白組比較有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3～圖5。

與空白組比較，＊P<0.05。圖3兩組大鼠造模14 d、21 d水平跨格數(shù)比較

與空白組比較，＊P<0.05。圖4兩組大鼠造模14 d、21 d站立次數(shù)比較

與空白組比較，＊P<0.05。圖5兩組大鼠造模14 d、21 d運(yùn)動(dòng)距離比較

2.4 懸尾實(shí)驗(yàn) 造模14 d，與空白組比較，模型組掙扎次數(shù)減少，不動(dòng)時(shí)間變長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模21 d，模型組懸尾實(shí)驗(yàn)掙扎次數(shù)較空白組明顯減少，不動(dòng)時(shí)間較空白組明顯變長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖6、圖7。

與空白組比較，＊P<0.05。圖6兩組大鼠造模14 d、21 d掙扎次數(shù)比較

與空白組比較，＊P<0.05。圖7兩組大鼠造模14 d、21 d不動(dòng)時(shí)間比較

2.5 血清中IgA、IgG、補(bǔ)體C3及血乳酸水平變化 與空白組比較，模型組血清中IgA、IgG、補(bǔ)體C3水平明顯降低(P<0.05)，血乳酸水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖8。

與空白組比較，＊P<0.05。圖8兩組IgA、IgG、補(bǔ)體C3及血乳酸水平比較(A為兩組IgA水平比較；B為兩組IgG水平比較；C為兩組補(bǔ)體C3水平比較；D為兩組血乳酸水平比較)

2.6 大鼠股四頭肌組織形態(tài)學(xué)變化 經(jīng)HE染色后鏡下觀察，空白組股四頭肌肌纖維輪廓清晰，多呈長圓柱狀，細(xì)胞核呈扁圓形或橢圓形，胞膜完整，肌節(jié)清晰可見。模型組較空白組細(xì)胞間隙小，部分肌纖維胞質(zhì)染色不均，胞核固縮、凝聚，部分可見炎癥細(xì)胞浸潤。詳見圖9。

圖9 兩組大鼠股四頭肌組織形態(tài)學(xué)變化(×200)

3 討 論

3.1 造模過程優(yōu)化 起初按照文獻(xiàn)[18]選擇造模方法，隔日進(jìn)行力竭游泳與慢性束縛實(shí)驗(yàn)，總造模時(shí)長為14 d，并于造模結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)與空白組比較均不明顯，提示此時(shí)模型尚未完全成熟。后對造模方法進(jìn)行了改進(jìn)與優(yōu)化，將造模計(jì)劃更改為21 d持續(xù)疲勞造模，同時(shí)將隔日交替實(shí)驗(yàn)改為每日上午力竭游泳，下午慢性束縛，造模結(jié)束后發(fā)現(xiàn)模型大鼠狀態(tài)符合成模標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 行為學(xué)檢測手段優(yōu)化

3.2.1 懸尾實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過程 首先，對于鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)的儀器經(jīng)過改良。參考文獻(xiàn)[19]實(shí)驗(yàn)，起初選擇自制鼠尾懸掛板，中央制作一個(gè)直徑約1 cm孔洞，將距大鼠尾端約2 cm部位穿過圓孔并固定，使大鼠呈倒掛姿勢離地面約1 m。經(jīng)初次實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)該種方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在明顯差異，塑料板的可視性引起大鼠恐慌情緒，大鼠固定位置偏下難以使大鼠完全固定等，都會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定干擾。為此，使用懸尾測定儀進(jìn)行觀察，將距大鼠尾端1 cm部分固定于儀器掛鉤上，兩側(cè)有木板阻擋大鼠視線，同時(shí)保持環(huán)境相對安靜，減少對大鼠的額外刺激，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果改善明顯，最后選擇懸尾測定儀作為觀察儀器。其次，對大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)測定時(shí)間也進(jìn)行調(diào)整，起初通過查閱文獻(xiàn)，選擇計(jì)算5 min內(nèi)大鼠的掙扎次數(shù)與不動(dòng)時(shí)間[20]。經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，大鼠在一開始懸掛時(shí)會(huì)進(jìn)行劇烈掙扎，情緒不穩(wěn)定，影響對于掙扎次數(shù)與不動(dòng)時(shí)間指標(biāo)的觀察，后經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)，將觀察時(shí)間調(diào)整為6 min，同時(shí)舍棄前2 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)記錄，僅記錄后4 min內(nèi)大鼠指標(biāo)變化。

同時(shí)需要注意，應(yīng)清除每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后上一只大鼠留下的糞便及尿液，避免影響下一只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)應(yīng)制止大鼠出現(xiàn)追求與攀爬自己尾巴的現(xiàn)象。分析時(shí)注意應(yīng)將僅有前肢但沒有后肢介入的小動(dòng)作視為不動(dòng)，因慣性產(chǎn)生的擺動(dòng)也應(yīng)視作不動(dòng)。

3.2.2 曠場實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過程 曠場實(shí)驗(yàn)選擇大小鼠開場測定儀器進(jìn)行觀察，初步測定時(shí)參考文獻(xiàn)[21-22]對大鼠進(jìn)入曠場后6 min內(nèi)的水平跨格數(shù)、站立次數(shù)、運(yùn)動(dòng)距離進(jìn)行觀察，后發(fā)現(xiàn)大鼠因初次進(jìn)入陌生環(huán)境會(huì)短暫因驚嚇恐懼心理活動(dòng)增多，但參考價(jià)值較低，應(yīng)被剔除。所以最后選擇只計(jì)入6 min中后4 min的數(shù)據(jù)，剔除前2 min的活動(dòng)記錄。

同時(shí)需要注意站立次數(shù)與水平跨格數(shù)的定義標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)固定且前后統(tǒng)一，3爪以上跨入臨格才可納入水平跨格數(shù)，兩前肢完全離地并保持直立可被統(tǒng)計(jì)為站立次數(shù)；每次曠場實(shí)驗(yàn)應(yīng)在同一時(shí)間段內(nèi)完成，避免大鼠活動(dòng)周期不同對結(jié)果的干擾。保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境安靜隔音，并且溫濕度保持一致。兩次實(shí)驗(yàn)間應(yīng)清潔曠場儀器，避免上次動(dòng)物留下殘余信息影響下次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.3 文獻(xiàn)方法與改進(jìn)方法的比較 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)選擇復(fù)合刺激造模方法，能夠從兩方面來模擬人類身體疲勞與心理疲勞的病理狀態(tài)，相較單因素造模更易出現(xiàn)疲勞狀態(tài)與心理應(yīng)激的改變，能有效體現(xiàn)機(jī)體的整體性，造模手段與病因密切相關(guān)，充分體現(xiàn)出該病發(fā)展的生理與病理機(jī)制，且引起的行為學(xué)改變持續(xù)時(shí)間較長[23]。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，按照文獻(xiàn)選擇的造模方案存在一定問題，模型大鼠一般狀態(tài)與體質(zhì)量改變明顯，但行為學(xué)檢測結(jié)果僅有改變趨勢，結(jié)果尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，針對造模方案進(jìn)行了調(diào)整，將14 d造模方法調(diào)整為21 d，同時(shí)加大造模強(qiáng)度，更改為單日力竭游泳與慢性束縛，并于21 d造模結(jié)束后檢測發(fā)現(xiàn)模型成功。

在模型檢驗(yàn)方面，國內(nèi)外研究通常進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)了解動(dòng)物的體力情況以及情緒反應(yīng)，依據(jù)動(dòng)物出現(xiàn)的體力疲勞程度與伴隨出現(xiàn)的精神變化來判斷造模成功與否[24]。因此，本研究選擇CFS模型大鼠一般狀態(tài)的改變以及行為學(xué)檢測結(jié)果(曠場實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn))作為主要觀察指標(biāo)，判斷模型的可靠性，并在此基礎(chǔ)上，加入血清學(xué)以及組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)，作為輔助檢測手段，充分觀察大鼠造模后生理狀態(tài)以及組織形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果表明，造模后免疫球蛋白IgA、IgG、補(bǔ)體C3水平降低，肌纖維活性降低且血乳酸囤積，提示模型大鼠免疫力及體力均出現(xiàn)下降趨勢，能充分反映大鼠的疲勞狀態(tài)，結(jié)合行為學(xué)指標(biāo)，從生理及心理雙角度、多層次地反映模型建立情況。

本研究使用的模型檢測手段也在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行不斷改進(jìn)，排除實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的多項(xiàng)干擾因素，如大鼠狀態(tài)不穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)時(shí)間段的選擇、對動(dòng)物行為的主觀判定等，可能對結(jié)果帶來的不穩(wěn)定影響，規(guī)范實(shí)驗(yàn)的步驟與數(shù)據(jù)納入規(guī)則，最終得到成熟有效、可重復(fù)的模型驗(yàn)證方法，為后續(xù)進(jìn)一步檢測治療后各組間差異提供了較好的可復(fù)制方法。詳見表2。

表2 文獻(xiàn)方法與改進(jìn)方法的比較

通過觀察CFS模型大鼠一般狀態(tài)變化、飲水量、攝食量、體質(zhì)量變化以及行為學(xué)指標(biāo)，對造模以及模型檢測環(huán)節(jié)進(jìn)行了反復(fù)驗(yàn)證，并加入相關(guān)血液學(xué)及免疫指標(biāo)，以及對模型大鼠股四頭肌組織形態(tài)學(xué)的觀察。本研究對大鼠心理狀態(tài)及生理變化等多項(xiàng)指標(biāo)變化進(jìn)行觀察，能將模型建立情況直觀量化體現(xiàn)出來，并能較好地對模型給予評價(jià)，可供后續(xù)相關(guān)CFS模型研究實(shí)驗(yàn)參考，并為其提供依據(jù)與支撐。