有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)TNFAIP3介導(dǎo)的NF-κB抑制磷酸誘導(dǎo)血管鈣化的影響

王 夢(mèng)，陳 芳，萬(wàn) 玉，柏中喜

心血管疾病是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)病人發(fā)病和死亡的主要原因[1]。CKD中的血管疾病涉及動(dòng)脈壁的內(nèi)膜層損傷、內(nèi)皮功能障礙和脂質(zhì)代謝障礙，中間層的損傷涉及礦物質(zhì)代謝紊亂并導(dǎo)致血管鈣化，這些因素會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[2]。此外，這兩種血管疾病有一些共同的病因，如炎癥、尿毒癥毒素和氧化應(yīng)激。CKD病人的心血管死亡率與內(nèi)側(cè)血管鈣化相關(guān)。血管鈣化在CKD早期發(fā)展，并在疾病晚期逐漸增加[3]。血管鈣化是CKD礦物質(zhì)骨病的一部分，與高磷血癥有關(guān)，是血管鈣化和心血管死亡的危險(xiǎn)因素，尤其在CKD病人中[4]。因此，磷酸鹽被認(rèn)為是一種血管鈣化發(fā)展的關(guān)鍵因素。血管鈣化被認(rèn)為是一個(gè)活躍的過(guò)程，主要由血管平滑肌細(xì)胞調(diào)節(jié)[5]。在高磷刺激期間，血管平滑肌細(xì)胞分化為具有成骨/成軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞。血管鈣化是一種機(jī)制復(fù)雜的生物調(diào)節(jié)過(guò)程，可由腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)/半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)信號(hào)通路介導(dǎo)[6]。據(jù)報(bào)道，TNFAIP3表達(dá)的上調(diào)對(duì)抗鈣化作用至關(guān)重要。TNFAIP3是NF-κB的靶基因，反過(guò)來(lái)通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制NF-κB活性[7]。定期有氧運(yùn)動(dòng)被廣泛認(rèn)為是降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的有效方法，最近世界衛(wèi)生組織建議成年人每周至少進(jìn)行150 min的有氧運(yùn)動(dòng)，以減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。有氧運(yùn)動(dòng)被證明可以減少炎癥并改善CKD病人的血管內(nèi)皮功能和動(dòng)脈僵硬度/順應(yīng)性。先前的研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以有效改善CKD病人的心肺功能和健康相關(guān)生活質(zhì)量[9]。盡管運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能是一個(gè)有前景的解決方案，但有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)CKD病人的影響尚未完全闡明。因此，本研究探討有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)TNFAIP3介導(dǎo)的NF-κB抑制磷酸誘導(dǎo)的血管鈣化的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠 選取50只12周齡C57Bl/6小鼠，體質(zhì)量(18±4)g，購(gòu)自南京博恩生物技術(shù)有限公司。將小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)無(wú)特定病原體環(huán)境：室內(nèi)恒溫24 ℃，空氣相對(duì)濕度60%，給予光照/黑暗循環(huán)(12 h光照、12 h黑暗交替)，飼養(yǎng)期間可隨意獲取食物和自來(lái)水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理進(jìn)行，并獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠分為對(duì)照組、模型組、有氧運(yùn)動(dòng)組，每組15只。對(duì)照組小鼠未進(jìn)行腎切除術(shù)，接受標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飲食；模型組通過(guò)腎切除術(shù)和高磷酸鹽飲食誘導(dǎo)小鼠CKD和血管鈣化；有氧運(yùn)動(dòng)組小鼠在成功誘導(dǎo)CKD和血管鈣化后，在跑步機(jī)上進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)，持續(xù)8周。

1.3 CKD模型建立 實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行右腎次全腎切除術(shù)，進(jìn)行左腎切除術(shù)。從外科手術(shù)中恢復(fù)后，飲食改為富含磷酸鹽的飲食(0.6%鈣、0.9%磷)，持續(xù)6周。通過(guò)光度法(FUJI FDC 3500i/4000i，Sysmex)測(cè)量模型小鼠血漿尿素氮(BUN)、磷酸鹽和鈣濃度，未進(jìn)行腎切除術(shù)的對(duì)照小鼠接受標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飲食。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)眶后穿刺收集血液。在吸入異氟醚麻醉下通過(guò)頸椎脫臼處死小鼠，快速收集主動(dòng)脈組織并速凍。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠有氧運(yùn)動(dòng) 對(duì)于有氧運(yùn)動(dòng)，小鼠從外科手術(shù)中恢復(fù)后在跑步機(jī)(哥倫布儀器exer-3/6/小鼠平板跑步機(jī))上適應(yīng)1周，并進(jìn)行為期8 周的鍛煉方案，期間沒(méi)有傾斜或電擊刺激。運(yùn)動(dòng)速度從每周 12.5 m/min增加到 18.5 m/min，每天運(yùn)動(dòng)時(shí)間從 30 min增加到50 min。由于小鼠之間的運(yùn)動(dòng)能力略有不同，因此，記錄每只小鼠的每日跑步距離，并將總跑步距離用作運(yùn)動(dòng)能力的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 Trifast 試劑(Peqlab)從小鼠主動(dòng)脈組織中分離總 RNA。使用 oligo(dT)12-18 引物(賽默飛世爾科技) 和SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶(賽默飛世爾科技) 對(duì) 2 μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 iCycler iQTM 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)系統(tǒng)(生物放射實(shí)驗(yàn)室)和 iQTM Sybr Green Supermix(生物放射實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行RT-PCR。PCR 產(chǎn)物的特異性通過(guò)熔解曲線分析得到證實(shí)。所有 PCR 均一式兩份進(jìn)行，相對(duì) mRNA 倍數(shù)變化通過(guò) 2-ΔΔCt方法使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈成骨標(biāo)志物、炎性因子mRNA表達(dá)，主動(dòng)脈成骨標(biāo)志物包括msh同源框2(MSX2)、核心結(jié)合因子α-1(CBFA1)和組織非特異性堿性磷酸酶(ALPL)；炎性因子包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡分析 將小鼠主動(dòng)脈組織用冰冷的免疫沉淀(IP)裂解緩沖液(賽默飛世爾科技)裂解，并輔以完整的蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(賽默飛世爾科技)。在 10 000 r/min 離心 5 min后，將蛋白質(zhì)在 Roti-Load1 緩沖液中于10 ℃下煮沸 10 min。在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜與一抗在 4 ℃下孵育過(guò)夜：小鼠抗 A20辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)(稀釋1∶1 000，sc-166692，圣克魯斯生物技術(shù)公司)，山羊抗NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)(1∶1 000，Abcam，USA)，兔抗磷酸化核因子κB抑制蛋白α(IκBα)(Ser32，稀釋 1∶1 000，#2859，Cell Signaling)，兔抗核因子κB抑制蛋白α(IκBα，稀釋 1∶1 000，#4814，Cell Signaling)，兔抗NF-κB p65(稀釋 1∶1 000，#8242，Cell Signaling)，人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2，1∶1 000，Abcam，USA)，Caspase-1(1∶1 000，Abcam)，或兔抗GAPDH 抗體(1∶5 000 稀釋?zhuān)?2118，Cell Signaling)，使用二級(jí)抗山羊HRP偶聯(lián)抗體(1∶5 000 稀釋?zhuān)タ唆斔股锛夹g(shù)公司)或抗兔 HRP 偶聯(lián)抗體(1∶1 000 稀釋)，Cell Signaling) 在室溫下保持 1 h。對(duì)于上樣對(duì)照，將膜在室溫下在剝離緩沖液(賽默飛世爾科技)中剝離10 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)用試劑(賽默飛世爾科技)檢測(cè)抗體。通過(guò)使用 Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行量化。通過(guò)蛋白印跡和RT-PCR檢測(cè)小鼠動(dòng)脈組織中TNFAIP3的mRNA和蛋白表達(dá)；通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈中磷酸化IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65蛋白表達(dá)以及主動(dòng)脈中血管鈣化、炎癥小體相關(guān)蛋白BMP2、NLRP3和Caspase-1表達(dá)。

1.4.4 血管鈣化的定量 細(xì)胞和主動(dòng)脈的鈣沉積通過(guò)鈣含量檢測(cè)試劑盒(Leagene，北京，中國(guó))進(jìn)行定量。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后收集血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)。對(duì)于主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈切成約 1mm3的碎片。主動(dòng)脈以3 000×g離心 3 min。上清液用于檢測(cè)鈣含量。在酶標(biāo)儀(VARIOSKAN LUX，美國(guó)熱科學(xué)公司)上在 610 nm 處測(cè)定吸光度。蛋白質(zhì)濃度通過(guò) BCATM蛋白質(zhì)測(cè)定法(Pierce，美國(guó))定量。鈣含量通過(guò)蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4.5 茜素紅染色 茜素紅染色用于動(dòng)脈鈣化，用PBS洗滌主動(dòng)脈以去除血液并在95%乙醇溶液中浸泡過(guò)夜。將主動(dòng)脈與溶解在 1% KOH 中的 0.004% 茜素紅孵育過(guò)夜，用 2% KOH 洗滌2次。對(duì)于主動(dòng)脈的paraffin部分，主動(dòng)脈段固定在4%多聚甲醛中并嵌入paraffin中。主動(dòng)脈樣本被切成 6 μm 厚。切片脫蠟，0.2%茜素紅染色5 min，去離子水洗滌。將切片依次在無(wú)水丙酮溶液中浸泡30 s，無(wú)水二甲苯浸泡1 min。

2 結(jié) 果

2.1 3組TNFAIP3表達(dá)比較 模型組TNFAIP3的mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低(P<0.05)，有氧運(yùn)動(dòng)組TNFAIP3的mRNA和蛋白表達(dá)較模型組升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 3組TNFAIP3表達(dá)比較(±s)

2.2 3組小鼠主動(dòng)脈中p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 模型組p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高(P<0.05)，有氧運(yùn)動(dòng)組p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運(yùn)動(dòng)降低小鼠NF-κB磷酸化和蛋白的表達(dá)。詳見(jiàn)圖1及表2。

圖1 蛋白印跡法檢測(cè)p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)

表2 3組小鼠主動(dòng)脈中p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較(±s)

2.3 3組主動(dòng)脈成骨標(biāo)志物mRNA表達(dá)比較 模型組MSX2、CBFA1和ALPL的mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高(P<0.05)，有氧運(yùn)動(dòng)組MSX2、CBFA1和ALPL的mRNA表達(dá)較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運(yùn)動(dòng)可降低主動(dòng)脈成骨標(biāo)志物mRNA表達(dá)。詳見(jiàn)表3。

表3 3組主動(dòng)脈成骨標(biāo)志物mRNA表達(dá)比較(±s)

2.4 3組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)比較 模型組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高(P<0.05)，有氧運(yùn)動(dòng)組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運(yùn)動(dòng)可抑制血管鈣化和炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)。詳見(jiàn)表4。

表4 3組BMP2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)比較(±s)

2.5 3組主動(dòng)脈鈣含量比較 通過(guò)鈣含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈中的鈣含量，模型組鈣含量較對(duì)照組升高(P<0.05)，有氧運(yùn)動(dòng)組鈣含量較模型組降低(P<0.05)。主動(dòng)脈切片茜素紅染色顯示，與對(duì)照組相比，模型組出現(xiàn)嚴(yán)重的血管鈣化，而有氧運(yùn)動(dòng)組抑制礦物質(zhì)沉積，血管鈣化較模型組減輕(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表5。

圖23 組小鼠主動(dòng)脈茜素紅染色結(jié)果

表5 3組主動(dòng)脈鈣含量比較(±s) 單位：μg/mg

2.6 有氧運(yùn)動(dòng)抑制血管鈣化 模型組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高(P<0.05)，有氧運(yùn)動(dòng)組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA表達(dá)較模型組降低(P<0.05)，提示有氧運(yùn)動(dòng)可降低小鼠體內(nèi)炎性因子表達(dá)。詳見(jiàn)表6。

表6 3組炎性因子的mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

CKD是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。成人CKD的身體素質(zhì)逐漸降低，主要原因是腎性貧血和骨骼肌疾病[10]。有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是應(yīng)用最廣泛的項(xiàng)目，定期鍛煉可改善CKD病人的心肺功能、力量和身體功能。據(jù)報(bào)道，在血壓正常和高血壓受試者中，有氧訓(xùn)練可以降低靜息血壓，尤其是在高血壓受試者中[11]。透析的CKD病人的發(fā)病率和死亡率風(fēng)險(xiǎn)增加，部分原因是與身體機(jī)能下降有關(guān)。幾項(xiàng)針對(duì)CKD的研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)身體機(jī)能和健康有益。炎癥是血管鈣化的促進(jìn)劑，不僅會(huì)引起血管平滑肌細(xì)胞損傷，還會(huì)導(dǎo)致肝臟分泌胎球蛋白A減少[12]。其他研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低非透析依賴(lài)性CKD病人的血漿C反應(yīng)蛋白(CRP)和IL-6水平。

本研究結(jié)果表明，主動(dòng)脈血管鈣化的小鼠在進(jìn)行漸進(jìn)式有氧運(yùn)動(dòng)后，其血管鈣化程度顯著降低。平滑肌細(xì)胞能夠在病理?xiàng)l件下改變其表型并釋放基質(zhì)囊泡并啟動(dòng)動(dòng)脈礦化，其過(guò)程類(lèi)似于生理性骨礦化。在高磷酸鹽刺激期間，平滑肌細(xì)胞分化為具有成骨/成軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞。表型轉(zhuǎn)分化的特征在于成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如MSX2和CBFA1。成骨/成軟骨細(xì)胞表達(dá)ALPL，它水解內(nèi)源性鈣化抑制劑焦磷酸鹽，從而促進(jìn)磷酸鈣晶體不受控制的形成[13]。平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)分化受復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，與全身炎癥有關(guān)，并且至少部分依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，已成為血管鈣化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。這項(xiàng)研究表明，在動(dòng)物模型中，有氧運(yùn)動(dòng)在血管鈣化期間提供了強(qiáng)大的保護(hù)作用，改善小鼠血管平滑肌細(xì)胞的骨/軟骨形成作用。有氧運(yùn)動(dòng)增加TNFAIP3表達(dá)，抑制高磷血癥期間NF-κB的活化。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB已成為血管平滑肌細(xì)胞軟骨形成分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。NF-κB激活導(dǎo)致MSX2依賴(lài)性ALPL表達(dá)，CBFA1上調(diào)并干擾平滑肌細(xì)胞中的抗鈣化途徑。有氧運(yùn)動(dòng)能夠改變NF-κB活性。TNFAIP3表達(dá)上調(diào)對(duì)介導(dǎo)有氧運(yùn)動(dòng)的抗鈣化作用至關(guān)重要[15]。TNFAIP3是NF-κB的靶基因，反過(guò)來(lái)通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制NF-κB活性。研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠高磷酸鹽飲食增加的IκBα磷酸化，而這些通過(guò)后期有氧運(yùn)動(dòng)逆轉(zhuǎn)。因此，通過(guò)上調(diào)TNFAIP3抑制NF-κB可能是有氧運(yùn)動(dòng)在鈣化中的保護(hù)作用的基礎(chǔ)。

本研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)影響NLRP3/Caspase-1和NF-κB通路來(lái)抑制體內(nèi)炎癥，從而減輕血管鈣化，有氧運(yùn)動(dòng)抑制血管平滑肌細(xì)胞中鈣沉積BMP2的表達(dá)。BMP2是平滑肌細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵標(biāo)志物。血管鈣化與肝臟和腎臟等多個(gè)器官有關(guān)，現(xiàn)在被認(rèn)為是一種類(lèi)似于成骨的活躍基因調(diào)節(jié)過(guò)程[16]。血管鈣化最明顯的病理特征是主動(dòng)脈中的礦物質(zhì)沉積。其他病理特征包括主動(dòng)脈彈性蛋白損傷和斷裂引起的管腔面積擴(kuò)大和主動(dòng)脈周長(zhǎng)延長(zhǎng)[17]。使用茜素紅染色的主動(dòng)脈旁切面進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。鈣含量的定量分析也顯示有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血管鈣化的抑制作用。結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1/IL-1β和NF-κB通路抑制炎癥。據(jù)報(bào)道，在CKD病人中發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的局部血管炎癥和全身炎癥[18]。在沒(méi)有可見(jiàn)礦物質(zhì)沉積的情況下甚至可以看到局部血管炎癥并且血管鈣化開(kāi)始于局部血管炎癥區(qū)域，這表明局部血管炎癥的發(fā)生早于血管鈣化[19]。血管炎癥會(huì)誘導(dǎo)主動(dòng)脈中的鈣沉積，而鈣沉積又通過(guò)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(如IL-1β和TNF-α)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致惡性循環(huán)，加重血管鈣化[20]。本研究結(jié)果顯示，接受腎次全切除術(shù)的小鼠在高磷酸飲食后誘導(dǎo)了IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表達(dá)，其中IL-1β表達(dá)最為明顯，有氧運(yùn)動(dòng)顯著下調(diào)上述促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究結(jié)果還顯示，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血管鈣化具有強(qiáng)大的抗炎作用。由于NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路介導(dǎo)炎癥，本研究探討了有氧運(yùn)動(dòng)在血管炎癥期間對(duì)該通路的影響。在血管炎癥過(guò)程中，NLRP3炎癥小體被激活，激活Caspase-1，隨后誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)血管炎癥的發(fā)生。

綜上所述，有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)TNFAIP的表達(dá)介導(dǎo)NF-κB磷酸化抑制，并阻礙NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的激活來(lái)抑制血管炎癥，從而防止血管鈣化。有氧運(yùn)動(dòng)在臨床上治療血管鈣化具有很大潛力，可以減少CKD病人血管鈣化和心血管疾病的進(jìn)展。