柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞焦亡的實(shí)驗(yàn)研究

趙洋洋，高吊清，劉 菲，武 鑫，賈旭林

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一種以心臟炎癥為特征的心血管疾病，多見于兒童和青少年，柯薩奇病毒B3(Coxsachie virus B3，CVB3)是最常見的病原體，其可導(dǎo)致心肌壞死，誘導(dǎo)心力衰竭和擴(kuò)張性心肌病，嚴(yán)重者可危及生命[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在CVB3感染心肌細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)了兩種程序性死亡方式，一種是依賴于半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和p53活化的細(xì)胞程序性死亡方式即細(xì)胞凋亡，另外一種是依賴 Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞死亡即細(xì)胞焦亡，細(xì)胞焦亡是高度炎癥性的程序性細(xì)胞死亡方式，其形態(tài)具有壞死和凋亡的特征[2-3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡在單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)誘導(dǎo)的病毒性心肌炎細(xì)胞模型中被激活，參與其病理過程[4]。細(xì)胞焦亡在許多炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，但其在CVB3所致的病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。本研究采用CVB3感染構(gòu)建病毒性心肌炎小鼠模型，探討CVB3可否通過誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞焦亡促進(jìn)心肌炎的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒株 Hep2 細(xì)胞購于中喬新舟生物科技有限公司。CVB3 Nancy 株購于 ATCC。

1.2 動(dòng)物 6周齡Bal b/c雄性小鼠30只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量16～20 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 兔抗小鼠Caspase-1、半胱天冬氨酸蛋白酶原(pro-Caspase-1)單克隆抗體購于Abcam；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)均購于Bioworld；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒均購于TaKaRa公司；Caspase-1、NLRP3購自華大基因(NLRP3正向引物：5′-CGAGACCTCTGGGAAAAAGCT-3′，反向引物：5′-GCATACCATAGAGGAATGTGATGTAC-3′；Caspase-1正向引物：5′-TGGTCTTGTGACTTGGAGGAC-3′，反向引物：5′-GGTCACCCCTATCAGCAGTGG-3′；GAPDH正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；反向引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購于江萊生物。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將30只小鼠分為對照組(10只)和實(shí)驗(yàn)組(20只)，對照組腹腔注射0.1 mL無菌生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射0.1 mL含105半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)CVB3病毒液，分別于感染后的第3天、第7天隨機(jī)選取10只小鼠處死，收集小鼠全血及心臟組織。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測NLRP3炎性小體及 Caspase-1 mRNA表達(dá)水平 取各組不同時(shí)間點(diǎn)心臟組織，按照說明書提取心肌組織中總RNA，測定總RNA濃度及純度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。以 GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算各組目的基因的2-△△CT值。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白水平 取各組小鼠心臟組織，超聲粉碎組織，冰上裂解提取蛋白， 10 000×g離心10 min，取上清測定蛋白含量并配平。配膠上樣后經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，對應(yīng)抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育，TBST洗膜3次。利用凝膠成像系統(tǒng)曝光，使用Image J軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。

1.4.4 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平的檢測 取對照組與實(shí)驗(yàn)組于感染后第3天、第7天小鼠，摘除眼球取血，將全血在室溫下放置1 h，待全血自然凝固并析出血清后，4 ℃環(huán)境下，1 000×g 離心20 min，收集血清。按照 ELISA 檢測試劑盒中說明書的步驟檢測小鼠血清 IL-1β含量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組心肌組織NLRP3炎性小體及 Caspase-1 mRNA表達(dá)比較 RT-qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組第3天、第7天處死小鼠的心肌組織中NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達(dá)較對照組明顯增加(P<0.05)。詳見圖1。

2.2 兩組心肌組織pro-Caspase-1及 Caspase-1蛋白水平比較 實(shí)驗(yàn)組第3天、第7天處死小鼠的心肌組織pro-Caspase-1、Caspase-1的蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增加(P<0.05)。詳見圖2～圖4。

與對照組比較，＊ P<0.05。圖1兩組心肌組織NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達(dá)比較

圖2 兩組心肌組織pro-Caspase-1及Caspase-1蛋白表達(dá)條帶圖

與對照組比較，＊ P<0.05。圖3兩組心肌組織pro-Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比較，＊ P<0.05。圖4兩組心肌組織 Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較

2.3 兩組小鼠血清IL-1β水平比較 實(shí)驗(yàn)組第3天、第7天血清IL-1β水平較對照組明顯增加(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組小鼠血清IL-1β水平比較(±s) 單位：ng/L

3 討 論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎的發(fā)病率和死亡率仍居高不下。CVB3感染是病毒性心肌炎的主要原因，可導(dǎo)致青壯年猝死或進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病。病毒性心肌炎的主要特征是局部和全身的炎癥反應(yīng)。雖然炎癥過程最終是病毒消除和愈合的必要免疫防御，但炎癥是造成心肌損傷的主要機(jī)制[5]。

細(xì)胞焦亡是細(xì)胞發(fā)生的一種依賴Caspase、炎癥小體介導(dǎo)的程序性死亡，其特征是gasdermin D(GSDMD)介導(dǎo)的膜孔形成、細(xì)胞腫脹和快速裂解，隨后大量釋放促炎介質(zhì)IL-1β、白細(xì)胞介素-18(IL-18)[6-7]。細(xì)胞焦亡不僅會(huì)引起局部炎癥，還會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的放大。細(xì)胞焦亡主要有兩種途徑：Caspase-1介導(dǎo)的典型途徑和Caspase-4/Caspase-5/Caspase-11介導(dǎo)的非典型途徑[8]。其中細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑是由炎性小體激活來介導(dǎo)完成的。炎性小體的基本結(jié)構(gòu)包括胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體(PRRs)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC) 和 pro-Caspase-1(CASP1)3部分[9-10]。NLRP3是目前研究較為深入的炎性小體，可被病毒、細(xì)菌、真菌的 DNA 或 RNA、紫外線等外源性危險(xiǎn)信號(hào)分子以及三磷酸腺苷(ATP)、晶體等內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子所激活[11-13]。NLRP3炎性小體被激活后，產(chǎn)生具有活性的Caspase-1，Caspase-1作用于細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白GSDMD，從而產(chǎn)生GSDMD-N末端的活化形式；GSDMD-N端與細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)組分結(jié)合導(dǎo)致GSDMD-N低聚化。在質(zhì)膜上形成非選擇性孔，使游離的細(xì)胞外水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞迅速膨脹和破裂，推動(dòng)細(xì)胞焦亡和釋放細(xì)胞內(nèi)容物，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[14]，同時(shí)GSDMD是炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18分泌和成熟所必需的介質(zhì)[15]，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。目前公認(rèn)的炎癥和細(xì)胞死亡在病毒性心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭中起重要作用[16]。越來越多的研究證實(shí)細(xì)胞焦亡與心血管疾病有關(guān)。

既往已有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3在CVB3所致心肌炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，NLRP3及IL-1β mRNA的表達(dá)水平在CVB3感染的小鼠心臟中明顯升高[17]。病毒性心肌炎病人外周血NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達(dá)水平升高[18]。

本研究采用CVB3感染構(gòu)建病毒性心肌炎小鼠模型，通過對發(fā)生細(xì)胞焦亡的過程中必要的信號(hào)分子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組第3天、第7天處死小鼠的心肌組織中NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達(dá)較對照組明顯增加；心肌組織pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增加；血清IL-1β表達(dá)較對照組明顯增加。NLRP3炎癥小體由 NLRP3、ASC 和 pro-Caspase-1 組成[4]。實(shí)驗(yàn)組心肌組織中NLRP3炎性小體mRAN及pro-Caspase-1的蛋白表達(dá)水平明顯增加，提示細(xì)胞焦亡已被激活。Caspase-1作為細(xì)胞焦亡的主要介導(dǎo)者，通過對其在實(shí)驗(yàn)組心肌組織中的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，可以證明Caspase-1已被活化，同時(shí)活化后的Caspase-1可加工分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β，從而放大局部炎癥反應(yīng)，本研究中實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IL-1β明顯升高，進(jìn)一步提示 NLRP3 炎癥小體-Caspase-1-IL-1β通路在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎病理生理過程中被激活，從而表明CVB3可通過誘導(dǎo)心肌發(fā)生細(xì)胞焦亡促進(jìn)心肌炎癥反應(yīng)的進(jìn)展。

綜上所述，通過對CVB3病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞焦亡的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CVB3可以通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡，從而促進(jìn)心肌炎的進(jìn)展。為臨床上診斷及尋找拮抗心肌細(xì)胞焦亡的藥物來減輕心肌炎癥反應(yīng)，預(yù)防心肌纖維化提供了新的思路及策略。