CPEB4基因緩解膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷及作用機(jī)制

孔曉艷，劉紀(jì)寧，熊 麗，樊 嬌，王 波

膿毒癥是一類(lèi)高致死性的疾病，最易影響心臟，可引起心臟結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而引起心力衰竭[1]。心肌損傷也是導(dǎo)致膿毒癥病人致死的原因[2]?；诖耍瑢ふ以缙谠\斷的治療方法可改善膿毒癥病人的心功能，延長(zhǎng)病人的壽命。目前，臨床通過(guò)一系列的生化標(biāo)志物診斷早期心肌損傷，如肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin，Mb)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin，cTnI)等，但這些生化標(biāo)志物易受釋放機(jī)制等因素的影響，在臨床早期診斷膿毒癥病人心肌損傷中有一定的限制[3]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases-1/2，ERK1/2)和p38，與炎癥反應(yīng)相關(guān)，可改善心肌功能損傷[4]。胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4(cytoplasmic polyadenylation element-binding proteins 4，CPEB4)是胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白家族(CPEBs)中的一員，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和血管生成等生理過(guò)程[5]。既往研究顯示，CPEB4可能通過(guò)ERK1/2和p38通路表達(dá)，抑制癌癥的生物學(xué)行為，但CPEB4基因在膿毒癥誘導(dǎo)心肌損傷中的作用機(jī)制尚不明確。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)膿毒癥大鼠凋亡模型，干擾CPEB4表達(dá)后，觀察大鼠心功能、病理變化、細(xì)胞凋亡情況以及對(duì)ERK1/2和p38信號(hào)通路的影響，為CPEB4作為改善心肌細(xì)胞損傷的有效治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 CK-MB、cTnI和Mb檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司； 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)默克生命科學(xué)；LPS購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；shRNA-NC及shRNA-CPEB4載體購(gòu)于RiboBio公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；CPEB4、p38、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；光學(xué)顯微鏡和低溫高速離心機(jī)均由本院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只雄性SD大鼠，8～12周齡，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，購(gòu)于廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司[SCXK(粵)2020-0055]，在本研究中心于室溫下分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.3 分組建模 將48只大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組(LPS誘導(dǎo)膿毒癥)、shRNA-NC組(LPS誘導(dǎo)膿毒癥+shRNA-NC)和shRNA-CPEB4組(LPS誘導(dǎo)膿毒癥心肌損傷+shRNA-CPEB4)，每組12只。向大鼠腹腔注射濃度為12 mg/kg的LPS，連續(xù)注射5 d，每天1次，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)膿毒癥大鼠模型。再向LPS誘導(dǎo)膿毒癥大鼠靜脈注射shRNA-NC，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)膿毒癥+shRNA-NC模型。再向LPS誘導(dǎo)膿毒癥大鼠靜脈注射shRNA-CPEB4，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)膿毒癥+shRNA-CPEB4模型。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 心功能指標(biāo)及cTnI、CK-MB和Mb水平檢測(cè) 采用心臟彩色多勒普超聲檢查心率、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左心室壁厚度(LVWT)。隨后，采取斷頸法處死大鼠取血，以3 500 r/min離心10 min，取血清，于-20 ℃溫度下暫存，取大鼠左心室部分組織保存于-80 ℃溫度。心肌損傷標(biāo)志物cTnI、CK-MB和Mb水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色觀察心肌損傷情況 取各組大鼠左心室心肌組織，用40 g/L多聚甲醛固定，采用常見(jiàn)的包埋切片，用HE進(jìn)行染色后觀察大鼠心肌組織損傷情況。

1.4.3 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡 取大鼠心肌組織石蠟切片，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行染色，在10×40的倍鏡下觀察大鼠心肌組織凋亡情況。

1.4.4 RT-PCR檢測(cè)CPEB4 mRNA表達(dá) 從大鼠心肌組織中提取RNA，根據(jù)試劑盒上的指示加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，后進(jìn)行擴(kuò)增。CPEB4：正向引物為5′-CUGCCUCAUUUGGCGAAUAC-3′，反向引物為5′-UAUUCGCCAAAUGAGGCAGC-3′，內(nèi)參照GAPDH引物：正向引物為GATGCTGGTGCTGAGTATGRCG，反向引物為GTGGTGCAGGATGCATTGCTCTGA。

1.4.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá) 從大鼠心肌組織中提取總蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜，添加脫脂奶粉，加入CPEB4、p38、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH一抗，隨后加入對(duì)應(yīng)的二抗，顯影獲取蛋白條帶，用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶的灰度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0和Gradpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)定量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足正態(tài)性且方差齊，多組間差異性采用單因素方差分析比較，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組CPEB4 mRNA及蛋白表達(dá)比較 模型組CPEB4 mRNA表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)，模型組CPEB4 mRNA表達(dá)與shRNA-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-CPEB4組CPEB4 mRNA表達(dá)水平明顯低于shRNA-NC組(P<0.05)。模型組CPEB4蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)，模型組與shRNA-NC組CPEB4蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-CPEB4組CPEB4蛋白表達(dá)水平明顯低于shRNA-NC組(P<0.05)。說(shuō)明CPEB4表達(dá)干擾成功。詳見(jiàn)圖1、圖2。

與正常組比較，＊P<0.05；與shRNA-NC組比較，#P<0.05。圖14組CPEB4 mRNA表達(dá)比較

與正常組比較，＊P<0.05；與shRNA-NC組比較，#P<0.05。圖24組CPEB4蛋白表達(dá)比較(A為4組CPEB4 蛋白表達(dá)條帶圖；B為CPEB4蛋白相對(duì)表達(dá)量)

2.2 4組心率、LVWT、LVEF水平比較 與正常組相比，模型組大鼠心率、LVWT和LVEF水平均明顯降低(P<0.05)；shRNA-NC組心率、LVWT和LVEF水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與shRNA-NC組比較，shRNA-CPEB4組大鼠心率、LVWT和LVEF水平均有明顯增加(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 4組心率、LVWT、LVEF水平比較(±s)

2.3 4組大鼠心肌損傷情況比較 正常組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，邊緣清晰，心肌纖維完整未出現(xiàn)破壞，無(wú)明顯異常。模型組心肌纖維斷裂，細(xì)胞變形，細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)部分核固縮。shRNA-NC組心肌組織病理變化與模型組比較無(wú)明顯差異；與shRNA-CPEB4組比較，shRNA-NC組心肌組織纖維斷裂情況有所減輕，其他病理變化均有所改善。詳見(jiàn)圖3。

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠CK-MB、Mb和cTnI水平明顯提高(P<0.05)；與shRNA-NC組比較，shRNA-CPEB4組大鼠CK-MB、Mb和cTnI水平明顯降低(P<0.05)；模型組與shRNA-NC組大鼠CK-MB、Mb和cTnI水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

圖34 組大鼠心肌組織病理變化情況(×400)(A為正常組；B為模型組；C為shRNA-NC組；D為shRNA-CPEB4組)

表2 4組大鼠CK-MB、Mb和cTnI水平比較(±s)

2.4 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較 TUNEL染色結(jié)果顯示，正常組心肌細(xì)胞排列整齊，分布均勻，無(wú)明顯異常情況；模型組心肌細(xì)胞分布紊亂，細(xì)胞數(shù)量缺失明顯增多，細(xì)胞數(shù)量壞死增多；shRNA-NC組心肌細(xì)胞分布散亂，出現(xiàn)較多的缺失或壞死的細(xì)胞；SHRNA-CPEB4組心肌細(xì)胞分布比較均勻整齊，有少量的缺失或壞死細(xì)胞。說(shuō)明CPEB4基因干擾在一定程度上能減弱心肌細(xì)胞凋亡。詳見(jiàn)圖4。

圖44 組大鼠心肌凋亡情況比較(×400)(A為正常組；B為模型組；C為shRNA-NC組；D為shRNA-CPEB4組)

2.5 4組大鼠心肌組織蛋白表達(dá)水平比較 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織p-ERK1/2/ERK1/2磷酸化p38(p-p38)/p38蛋白水平增加(P<0.05)；與shRNA-NC組相比，shRNA-CPEB4組大鼠心肌組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。模型組與shRNA-NC組p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38蛋白水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。詳見(jiàn)圖5、圖6。

與正常組比較，＊P<0.05；與shRNA-NC組比較，#P<0.05。圖54組大鼠心肌組織p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)比較(A為p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)條帶圖；B為p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)柱狀圖)

與正常組比較，＊P<0.05；與shRNA-NC組比較，#P<0.05。圖64組大鼠心肌組織p-p38/p38蛋白表達(dá)比較(A為p-p38/p38蛋白表達(dá)條帶圖；B為p-p38/p38蛋白表達(dá)柱狀圖)

3 討 論

已有諸多報(bào)道CPEB4在生物體有絲分裂和早期胚胎分裂時(shí)轉(zhuǎn)錄發(fā)揮至關(guān)重要的作用，CPEB4參與細(xì)胞的分化，調(diào)控衰老和凋亡過(guò)程，與膿毒癥誘導(dǎo)心肌損傷生理活動(dòng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CPEB4基因在膿毒癥大鼠心肌組織中高表達(dá)，CPEB4基因干擾后，CPEB4基因mRNA水平表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明CPEB4基因干擾成功。本研究中，模型組心率、LVEF和LVWT水平較正常組明顯降低，CEPB4基因干擾后，shRNA-CPEB4組心率、LVEF和LVWT水平較shRNA-NC組明顯增加，說(shuō)明CEPB4基因干擾后，可以改善膿毒癥大鼠的心功能。同時(shí)，HE和TUNEL染色結(jié)果顯示，膿毒癥誘導(dǎo)心肌細(xì)胞大量壞死、凋亡，而CPEB4基因敲除后，心肌細(xì)胞壞死情況有所緩解，CPEB4基因干擾在一定程度上能減弱心肌細(xì)胞凋亡，說(shuō)明CEPB4基因可能參與膿毒癥誘導(dǎo)心肌損傷的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA-NC組大鼠心肌組織Mb、CK-MB和cTnI水平明顯增加，而CEPB4基因干擾后，SHRNA-CPEB4組CK-MB、Mb和cTnI水平明顯降低，表明CEPB4基因干擾后可改善膿毒癥大鼠心功能和心肌損傷。有研究表明，CK-MB、Mb和cTnI在心肌損傷病人中濃度較高，可作為心肌損傷的生化標(biāo)志物[6]。cTnI為一種典型的心臟肌鈣蛋白化合物，多存在于心肌和骨骼肌中，當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血缺氧等因素遭到損傷時(shí)，細(xì)胞釋放cTnI到血液進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致機(jī)體cTnI水平增加，因此，cTnI診斷心肌損傷具有良好的靈敏度[7]。CK-MB、Mb同樣也是臨床應(yīng)用較多的心肌損傷生化標(biāo)志物。

CPEB4基因位于人類(lèi)染色體的5q21，是一類(lèi)影響神經(jīng)細(xì)胞的蛋白，在多種疾病中表達(dá)，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的生理活動(dòng)[8-11]，且已被證實(shí)與MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路有關(guān)[12]。膿毒癥誘導(dǎo)的心肌組織中p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38蛋白水平增加，而CPEB4干擾后，p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38蛋白表達(dá)明顯減少。結(jié)果表明，CPEB4可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2和p38信號(hào)通路緩解膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷。ERK1/2和p38是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子，參與細(xì)胞的增殖與分化，進(jìn)入細(xì)胞程序性凋亡[13-16]。MAPK信號(hào)通路涉及多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等過(guò)程，尤其在肌細(xì)胞分化中發(fā)揮重要的作用[17-19]。ERK/MAPK和p38 MAPK途徑是其中兩條重要的信號(hào)通路。p38是一類(lèi)最早發(fā)現(xiàn)與應(yīng)激有關(guān)的酪氨酸化蛋白激酶，介導(dǎo)炎癥、凋亡等多種生理活動(dòng)[20]。有研究顯示，miRNA-138可通過(guò)c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38 MAPK信號(hào)通路抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)再生大鼠心肌細(xì)胞[21]。ERK是胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，包括ERK1和ERK2，是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵激酶[22]。ERK位于胞漿，激活后轉(zhuǎn)移至胞核，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)抑制細(xì)胞凋亡。有研究表明，下調(diào)miR-92a表達(dá)可通過(guò)ERK/MAPK信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡[23]。本研究中，膿毒癥可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ERK/MAPK通路和p38 MAPK通路應(yīng)激性激活，而CPEB4表達(dá)干擾后，抑制了膿毒癥所誘導(dǎo)的蛋白磷酸化水平的增加。

綜上所述，干擾大鼠心肌細(xì)胞CPEB4表達(dá)可能通過(guò)抑制ERK/MAPK通路和p38 MAPK通路的磷酸化，抑制膿毒癥誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌功能。提示CPEB4可能對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷發(fā)揮心肌保護(hù)作用，目前尚沒(méi)有針對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷的統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)，需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CPEB4在心肌保護(hù)方面的作用。