基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討人參、丹參、葶藶子治療慢性心力衰竭的分子機(jī)制

黎燚華，陳 琦，康 亮，張志敏，趙新軍，李 榮

慢性心力衰竭是指心臟結(jié)構(gòu)和/或功能的異常，使心室收縮和/或舒張功能發(fā)生障礙，從而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在心力衰竭治療中常用的藥物包括強(qiáng)心劑、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑等。強(qiáng)心劑與利尿劑可改善病人血流動力學(xué)，快速改善心力衰竭癥狀。ACEI/ARB、β受體阻滯劑及醛固酮受體拮抗劑可以抑制心室重構(gòu)，延緩心力衰竭進(jìn)展[1]，被稱為治療心力衰竭的“金三角”藥物。盡管如此，心力衰竭易損期的死亡率和再入院率仍舊居高不下，是目前心血管領(lǐng)域亟待攻克的難題。

越來越多研究表明，中醫(yī)藥在治療心力衰竭的過程中可發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)作用，具有多靶點、多通路的特點。中醫(yī)認(rèn)為，心為“君主之官”“主身之血脈”，若諸類病因影響及心，致心氣虛弱，心氣虛則其行血功能下降，氣不行血，血行不暢則致血瘀。血瘀會導(dǎo)致機(jī)體各部分受精氣充養(yǎng)減少而出現(xiàn)功能異常。當(dāng)肺、脾、腎等主管機(jī)體水液代謝的臟腑出現(xiàn)功能失調(diào)時，則出現(xiàn)水液不化，產(chǎn)生水飲之邪留于體內(nèi)。瘀和水是心力衰竭最常見的病理產(chǎn)物，兩者同屬陰邪，瘀水互結(jié)，易進(jìn)一步損傷心氣，最終損及心陽、心陰，氣血衰敗，發(fā)展為心力衰竭。由此可見，心力衰竭的病機(jī)為本虛標(biāo)實，本虛包括心氣虛、心陽虛、心陰虛，標(biāo)實多為血瘀、水停。標(biāo)本俱病，虛實夾雜。心氣虛是心力衰竭發(fā)病的始動環(huán)節(jié)，血瘀、水停為最常見的病理產(chǎn)物，同時又可作為致病因素進(jìn)一步損傷心氣，形成惡性循環(huán)[2]。

心力衰竭的治療關(guān)鍵在于截斷病機(jī)中的惡性循環(huán)，此過程中的中醫(yī)治療需遵循“補(bǔ)虛瀉實”的原則。針對心力衰竭“虛”“瘀”“水”三位一體的本虛標(biāo)實病機(jī)，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科李榮教授提出，在心力衰竭的治療中當(dāng)標(biāo)本同治，善用補(bǔ)氣、活血、利水三大法則，以“補(bǔ)氣藥、活血藥、利水藥”構(gòu)建中醫(yī)治療心力衰竭的“藥物金三角”[3]。李榮教授認(rèn)為，補(bǔ)氣可補(bǔ)充心臟動力、恢復(fù)心臟正氣、提升心臟功能，是保障心主血脈的功能正常發(fā)揮的基礎(chǔ)。同時兼以活血、利水之法，前者是截斷心力衰竭病機(jī)中不良循環(huán)的關(guān)鍵，后者則是祛除病理產(chǎn)物的重要手段。眾多臨床研究表明，中醫(yī)“藥物金三角”對于心力衰竭具有顯著療效，但其中的分子機(jī)制尚未被闡明。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，基于中醫(yī)“藥物金三角”的代表性藥物人參、丹參、葶藶子，探討其治療心力衰竭的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 中醫(yī)“藥物金三角”成分搜集與靶點預(yù)測 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)[4]數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索人參、丹參、葶藶子的化學(xué)成分，并利用該數(shù)據(jù)庫推薦的口服生物利用度(OB)≥20%和類藥性(DL)≥0.1進(jìn)行潛在活性成分的篩選。隨后下載篩選后的潛在活性成分的＊.mol2格式3D結(jié)構(gòu)文件，利用Open Babel 3.1.1軟件將＊.mol2文件轉(zhuǎn)換為簡化分子線性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry system，SMILES)。接著利用SEA[5]數(shù)據(jù)庫(https://sea.bkslab.org/)和HITPICK[6]數(shù)據(jù)庫(http://mips.helmholtz-muenchen.de/hitpick/cgi-bin/index.cgi?content=targetPrediction.html)對潛在活性成分進(jìn)行靶點預(yù)測。

1.2 心力衰竭致病基因搜集 分別利用“heart failure”“congestive heart failure”和“chronic heart failure”作為檢索詞在GeneCards[7]數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、CTD[8]數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)和DrugBank[9]數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)檢索并獲取心力衰竭的致病基因，對其結(jié)果進(jìn)行整合。

1.3 藥物對心力衰竭作用靶點的篩選 利用在線韋恩圖工具Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取所有藥物與心力衰竭的作用靶點，將其命名為“映射靶點”。隨后分別獲取補(bǔ)氣藥、活血藥和利水藥與心力衰竭的作用靶點。

1.4 映射靶點的蛋白互作分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING[10]數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)對藥物作用于心力衰竭的靶點進(jìn)行蛋白-蛋白互作(PPI)分析，并利用Cytoscape 3.7.2軟件[11]對PPI關(guān)系進(jìn)行可視化分析和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.5 藥物對心力衰竭作用靶點的富集分析 將藥物對心力衰竭的作用靶點提交至STRING網(wǎng)站中進(jìn)行富集分析，包括基因本體(GO)的生物過程富集分析(GO-BP)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析，使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接分析 從PDB[12]數(shù)據(jù)庫中獲取受體蛋白的＊.pdb格式3D結(jié)構(gòu)文件，利用ADT軟件對蛋白進(jìn)行去除水分子、加極性氫、計算電荷、確定對接口袋，并輸出為＊.pdbqt格式文件，作為分子對接的受體庫。使用Raccoon軟件[13]對潛在活性成分的＊.mol2格式3D結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行批量預(yù)處理，輸出保存為＊.pdbqt格式文件，作為分子對接的配體庫。隨后使用Autodock Vina[14]對受體及配體進(jìn)行半柔性對接。

2 結(jié) 果

2.1 藥物成分 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索獲得人參成分190個、丹參成分202個、葶藶子成分68個，經(jīng)過OB及DL篩選，共獲得藥物潛在活性成分187個，其中人參潛在活性成分66個，丹參潛在活性成分97個，葶藶子潛在活性成分24個。部分潛在活性成分及其參數(shù)見表1。

表1 部分潛在活性成分的相關(guān)信息

2.2 藥物靶點及心力衰竭致病基因 經(jīng)過SEA及HITPICK數(shù)據(jù)庫預(yù)測，共獲得藥物對應(yīng)靶點455個，其中人參靶點341個，丹參靶點287個，葶藶子靶點264個。另外，從GeneCards、DrugBank、CTD數(shù)據(jù)庫中共獲得心力衰竭致病基因710個。通過構(gòu)建韋恩圖，發(fā)現(xiàn)人參、丹參、葶藶子分別通過69個、63個和61個靶點作用于心力衰竭。經(jīng)過去重，發(fā)現(xiàn)這3種藥物共通過97個靶點作用于心力衰竭，這97個靶點被定義為映射靶點。利用STRING網(wǎng)站對映射靶點進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，隨后利用Cytoscape 3.7.2對結(jié)果進(jìn)行拓?fù)浞治鲆垣@取節(jié)點的度值(Degree)。節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要，則節(jié)點的Degree越大。該網(wǎng)絡(luò)中共包含87個靶點、598個相互作用關(guān)系，平均度值為6.87。其中腫瘤壞死因子(TNF，Degree=26)、血管內(nèi)皮生長因子 A(VEGFA，Degree=24)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3，Degree=23)、絲裂原激活的蛋白激酶8(MAPK8，Degree=22)、清蛋白(ALB，Degree=22)等靶點是映射靶點中的關(guān)鍵靶點。詳見圖1。

圖1 映射靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 富集分析

2.3.1 映射靶點 利用在線網(wǎng)站STRING對映射靶點進(jìn)行GO-BP和KEGG富集分析。結(jié)果顯示，映射靶點共富集到GO-BP條目1 116條、KEGG條目144條。其中，排名前30位的GO-BP及KEGG條目見圖2、圖3?？梢?，人參、丹參、葶藶子在治療心力衰竭時涉及對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)(GO：0042221)、對藥物的反應(yīng)(GO：0042493)、炎癥應(yīng)答(GO：0006954)、對外部刺激的反應(yīng)(GO：0009605)、對激素的反應(yīng)(GO：0009725)等主要的生物過程以及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路(hsa04933)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路(hsa04024)、胰島素抵抗(hsa04931)、白介素-17信號通路(hsa04657)、Toll樣受體信號通路(hsa04620)等關(guān)鍵通路。

圖2 映射靶點GO-BP通路富集分析(前30位)

圖3 映射靶點KEGG通路富集分析(前30位)

2.3.2 人參、丹參、葶藶子靶點 為了探討補(bǔ)氣、活血、利水藥物在治療心力衰竭中的異同，對3類藥物作用于心力衰竭的靶點分別進(jìn)行了KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示，人參、丹參、葶藶子作用于心力衰竭的靶點富集所得KEGG通路條目的數(shù)量分別為83個、107個和94個。利用韋恩圖對3類藥物的KEGG通路條目進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3類藥物在治療心力衰竭時涉及了共同的通路，同時3類藥物具有各自獨特的通路。詳見圖4。

圖4 中醫(yī)“藥物金三角”作用于心力衰竭的靶點的KEGG通路分析

其中，3類藥物共有的關(guān)鍵KEGG通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(hsa04933)、cAMP信號通路(hsa04024)、Toll樣受體信號通路(hsa04620)、白介素-17信號通路(hsa04657)等；人參獨有的關(guān)鍵通路有凋亡-多個物種(hsa04215)、皮質(zhì)醇的合成和分泌(hsa04927)等；丹參獨有的關(guān)鍵通路包括Rap1信號通路(hsa04015)、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)(hsa04810)、酪氨酸激酶(JAK)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號通路(hsa04630)等；葶藶子獨有的關(guān)鍵通路包括心肌收縮(hsa04260)、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hsa04261)、醛固酮的合成和分泌(hsa04925)等；此外，在人參與葶藶子共有的通路中包括NOD樣受體信號通路(hsa04621)、醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收(hsa04960)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路(hsa04022)等。這些通路都與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。

2.4 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 以“heart failure”為檢索詞，在MalaCards[15]數(shù)據(jù)庫(https://www.malacards.org/)中檢索與心力衰竭相關(guān)的通路，共獲得與心力衰竭密切相關(guān)的13個信號通路，其中包含了前面獲得的5個信號通路，分別為cAMP信號通路(hsa04024)、心肌收縮(hsa04260)、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hsa04261)、醛固酮的合成和分泌(hsa04925)、cGMP-PKG信號通路(hsa04022)。這5個信號通路中共包括14個靶點，對應(yīng)于52個潛在活性成分。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，詳見圖5。通路之間通過1個或多個靶點形成相互聯(lián)系，而1個靶點又可對應(yīng)于來自不同藥物的多個活性成分。因此，中醫(yī)“金三角藥物”可以通過多成分對應(yīng)多靶點，對多個心力衰竭的重要通路產(chǎn)生影響，形成一個復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從而發(fā)揮治療作用。

圖5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.5 分子對接分析 為了探討“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中靶點與潛在活性成分的作用關(guān)系，選取人參、丹參、葶藶子的共同靶點(ABCC4、NFKB1、PPARA)與52個潛在活性成分進(jìn)行半柔性分子對接。

2.5.1 對接相關(guān)信息 由于PDB數(shù)據(jù)庫中無ABCC4相關(guān)信息，故使用SWISS-MODEL[16]數(shù)據(jù)庫(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模以獲取ABCC4的3D結(jié)構(gòu)文件。隨后利用PROTEINS PLUS[17]網(wǎng)站(https://proteins.plus/)進(jìn)行口袋預(yù)測以獲取對接口袋。詳見表2。

表2 受體基本信息與對接口袋數(shù)據(jù)

2.5.2 分子對接結(jié)果 分子對接結(jié)果顯示，NFKB1、PPARA、ABCC4與52個潛在活性成分的結(jié)合能均小于0，最高為-15.062 kJ/mol，最低為-41.422 kJ/mol，總平均結(jié)合能為-29.246 kJ/mol。NFKB1、PPARA、ABCC4與潛在活性成分的平均結(jié)合能分別為-24.267 kJ/mol、-30.543 kJ/mol和-33.054 kJ/mol。另一方面，與3個受體結(jié)合最好的潛在活性成分為蝙蝠葛堿(MOL001965)、丹酚酸J(MOL007142)、異丹參酮Ⅱ(MOL007111)、茯苓甾醇(MOL001659)、吳茱萸苷(MOL003909)等。詳見表3。

表3 分子對接結(jié)果

3 討 論

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)，對中醫(yī)“藥物金三角”治療心力衰竭的分子機(jī)制進(jìn)行了闡釋。研究結(jié)果表明，中醫(yī)“藥物金三角”的代表藥物人參、丹參、葶藶子可通過97個靶點作用于心力衰竭，其中TNF、VEGFA、STAT3、MAPK8、ALB等為關(guān)鍵靶點。相關(guān)研究表明，慢性過表達(dá)TNF會引起心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡、心臟射血分?jǐn)?shù)降低等，促進(jìn)心力衰竭發(fā)展[18]。VEGFA參與心血管的形成、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與活化等，在失代償心力衰竭的心臟中，可觀察到VEGFA的表達(dá)降低，提示VEGFA是心力衰竭的一個潛在治療靶點[19]。STAT3對于維持心臟的正常功能具有重要作用，內(nèi)源性正常水平的STAT3可減輕心臟肥大，但STAT3在心肌細(xì)胞中過表達(dá)或缺失都會引起心肌肥厚及心臟纖維化，促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展[20]。MAPK8是絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的成員，是血管緊張素Ⅱ以及腎上腺素能激動劑促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大過程的重要機(jī)制[21]。ALB是調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓的關(guān)鍵物質(zhì)，同時還是外源性藥物的在體蛋白，其水平對于心力衰竭轉(zhuǎn)歸具有優(yōu)良的預(yù)測價值[22]。GO-BP表明，映射靶點參與機(jī)體對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、炎癥應(yīng)答、對外部刺激的反應(yīng)、對激素的反應(yīng)等生物過程。

此外，本研究還從通路層面闡述了中醫(yī)“藥物金三角”治療心力衰竭的機(jī)制。通路富集分析表明，cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路、心肌收縮、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號、醛固酮的合成和分泌是中醫(yī)“藥物金三角”治療心力衰竭的關(guān)鍵信號通路。cAMP與cGMP屬于第二信使，是心臟功能的重要調(diào)節(jié)因子，cAMP是由兒茶酚胺刺激G蛋白偶聯(lián)受體的腺苷酸環(huán)化酶而產(chǎn)生的，可通過下游的蛋白激酶A(PKA)調(diào)節(jié)心臟收縮與舒張的強(qiáng)度和頻率。cGMP是在鳥苷環(huán)化酶受到一氧化氮和利鈉肽的作用后產(chǎn)生的，可通過激活其下游效應(yīng)蛋白激酶G和環(huán)核苷酸門控通道調(diào)節(jié)心臟收縮力和代謝反應(yīng)[23]。cAMP與cGMP在功能上常常表現(xiàn)出對心臟的相反作用，且兩者之間存在密切的相互調(diào)節(jié)。此外，研究表明，cAMP信號通路在心力衰竭發(fā)展過程中具有抑制心肌肥厚的作用[24]。cGMP可作為利鈉肽物質(zhì)的第二信使，可調(diào)節(jié)心肌收縮力、發(fā)揮排鈉利尿的作用，還可減弱兒茶酚胺類物質(zhì)對心臟的刺激作用，抑制心肌重構(gòu)[25]。在人類的心臟上，β1受體是主要的腎上腺素能受體，當(dāng)其被激動時可使心臟產(chǎn)生正性變時和正性變力效應(yīng)，這是心力衰竭初期心臟代償?shù)闹匾緩?。但長期、慢性的β1受體激動對心臟是有害的，可誘導(dǎo)心肌肥大甚至細(xì)胞凋亡。由腎上腺皮質(zhì)分泌的醛固酮具有保鈉保水的作用，與腎素、血管緊張素構(gòu)成腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，在心力衰竭初期可通過增加心臟后負(fù)荷而保證相對穩(wěn)定的心輸出量，但長期的醛固酮水平增加會啟動心肌肥大和間質(zhì)纖維化的病理過程[26]。分子對接結(jié)果表明，這些關(guān)鍵通路中的靶點與藥物潛在的活性成分具有良好的結(jié)合活性，佐證了中醫(yī)“藥物金三角”可通過干預(yù)這些重要靶點與關(guān)鍵通路，發(fā)揮治療心力衰竭的作用。

綜上所述，中醫(yī)“藥物金三角”治療心力衰竭涉及了多成分、多靶點、多通路，以復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的形式調(diào)控心力衰竭時心肌收縮、心臟負(fù)荷、心室重構(gòu)等生理病理過程，這為進(jìn)一步的研究提供了方向。