基于多維組學(xué)的冠心病遺傳研究進(jìn)展

張煒林，曹 宇，蔣立虹

(1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2云南省第一人民醫(yī)院心外科，云南 昆明 650032)

冠心病(coronary heart disease，CHD)的病因受控于多種危險因素，其傳統(tǒng)危險因素有高血壓、吸煙、血脂異常、肥胖、性格和陽性家族史。早在20世紀(jì)50年代的臨床觀察研究就支持CHD風(fēng)險是可遺傳的觀點[1]。根據(jù)最新全球疾病負(fù)擔(dān)研究專題報告，在中老年群體中，缺血性心臟病居十大病因之首[2]。CHD是心血管疾病導(dǎo)致死亡的主要原因，約占所有病例的45%[3]。多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析在國內(nèi)外心血管領(lǐng)域相關(guān)研究中已有報道，本文從基因組學(xué)、表觀組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、空間組學(xué)等不同維度對CHD遺傳學(xué)研究進(jìn)展及其風(fēng)險預(yù)測進(jìn)行深入探討，將進(jìn)一步明確CHD疾病遺傳機(jī)制，并提供風(fēng)險評估。

1 基因組學(xué)與CHD

基因組學(xué)是有關(guān)人類基因組構(gòu)成、基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及表達(dá)調(diào)控的研究。人類基因組的遺傳變異是常見的(等位基因頻率>1%)，即常見變異為常見病遺傳風(fēng)險的主要來源[4]?；诟咄糠治龊蜋z測技術(shù)，可對數(shù)千個靶點和通路篩選得到CHD常見基因變異位點，對CHD進(jìn)行預(yù)測并干預(yù)，可避免嚴(yán)重的不良心血管事件發(fā)生。既往研究中已發(fā)現(xiàn)包含CHD在內(nèi)的7種常見病基因，建立了相關(guān)的基因信息數(shù)據(jù)庫[5]。近年來,全基因組關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)的CHD易感基因已超過160個易感位點[6]，極大地促進(jìn)了CHD遺傳研究進(jìn)程。

1.1 CHD基因組學(xué)方法

基因組學(xué)方法有連鎖分析法、候選基因關(guān)聯(lián)分析法、全基因組關(guān)聯(lián)性研究以及直接測序法(包括全外顯子和全基因組測序)。此外，罕見變異關(guān)聯(lián)研究在測序技術(shù)日臻成熟的背景下，將發(fā)現(xiàn)CHD中更多的罕見遺傳變異(1%～5%)。

1.2 CHD相關(guān)生物學(xué)通路基因表達(dá)

基因組學(xué)研究揭示CHD基因表達(dá)的生物學(xué)信號通路。此外，基因組非編碼區(qū)突變可能改變基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或穩(wěn)定性，促進(jìn)CHD的發(fā)生和進(jìn)展。當(dāng)前，低密度脂蛋白膽固醇和脂蛋白(a)、甘油三酯的脂蛋白、炎癥、細(xì)胞增殖、血管重塑、血管張力及一氧化氮(nitric oxide，NO)信號為CHD基因組學(xué)中研究的熱點方向。

1.2.1 低密度脂蛋白膽固醇和脂蛋白(a) ZHAO等[7]構(gòu)建Ldlr突變引起的家族性高膽固醇血癥小鼠模型，高脂喂養(yǎng)誘發(fā)小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的動脈粥樣硬化，通過AAV-CRISPR/Cas9治療后實驗組小鼠動脈粥樣硬化相關(guān)血清標(biāo)志物減低、斑塊維持穩(wěn)定，將來可能成為家族性高脂血癥治療的方向。最近研究表明，個體ABCG5/8轉(zhuǎn)運蛋白序列變異降低，循環(huán)中非高密度脂蛋白膽固醇、植物甾醇含量升高，可促進(jìn)動脈粥樣硬化形成并伴隨CHD風(fēng)險增加[8]。

1.2.2 甘油三酯的脂蛋白 20世紀(jì)80年代，NAMBOODIRI等[9]證實血液中脂蛋白和脂質(zhì)的濃度是由遺傳所致。此后的研究表明，甘油三酯濃度與CHD風(fēng)險之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性[10]。一項全基因組關(guān)聯(lián)研究報道，載脂蛋白A5基因多態(tài)性是甘油三酯濃度最強(qiáng)的遺傳決定因素[11]。同時，最近的一項薈萃分析表明，循環(huán)中低密度脂蛋白膽固醇水平降低，主要血管事件持續(xù)減少且無副作用[12]。因此，血漿總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯濃度是冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)的危險因素。脂質(zhì)常見變異基因組研究提示，全基因組與脂質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)，血脂相關(guān)基因位點與CHD發(fā)病相關(guān)[13]。

1.2.3 炎癥 CHD與冠狀動脈粥樣硬化關(guān)聯(lián)密切，而動脈粥樣硬化形成的不同階段皆有炎癥細(xì)胞及炎性介質(zhì)參與，表明慢性炎癥反應(yīng)在CHD中是重要促發(fā)因素。研究認(rèn)為促進(jìn)冠狀動脈血管炎癥發(fā)生發(fā)展的炎性因子包括白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、干擾素-γ、TH1細(xì)胞因子(INF-γ)、IL-6、TNF相關(guān)蛋白1等，亦包括有抗炎作用的基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)物、IL-37等物質(zhì)。

1.2.4 細(xì)胞增殖和血管重塑COL4A1/COL4A2屬于IV型膠原基因家族，IV型膠原是基底膜的主要結(jié)構(gòu)組成，轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路激活下游SMAD通路在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上調(diào)COL4A1和COL4A2基因的表達(dá)，促使IV型膠原抑制平滑肌細(xì)胞生長，減少炎癥基因表達(dá)，限制對低密度脂蛋白的攝取，進(jìn)而抑制冠狀動脈粥樣硬化形成[14]，而YANG等[15]在全基因組關(guān)聯(lián)研究中也印證了COL4A1/2與動脈粥樣硬化相關(guān)。

1.2.5 血管張力和NO信號 NO以L-精氨酸為合成底物，在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)經(jīng)NO合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的催化作用生成。NO信號通路是血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)血管舒張/收縮的關(guān)鍵。NO脂溶性好，易透過血管內(nèi)膜，發(fā)揮抑制血小板聚集、白細(xì)胞黏附、舒張血管等功能。主要研究基因包括GUCY1A3、EDNRA、NOS3等。進(jìn)一步薈萃分析顯示，內(nèi)皮型NOS基因多態(tài)性與急性冠狀動脈綜合征或急性心肌梗死的風(fēng)險有關(guān)[16]。

2 CHD表觀組學(xué)

表觀遺傳調(diào)控不改變原遺傳序列，影響轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控達(dá)到對基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。表觀遺傳學(xué)修飾主要包括DNA甲基化與組蛋白修飾及非編碼RNA，個體表觀遺傳識別有助于心血管疾病診斷、預(yù)測和預(yù)后生物標(biāo)志物及藥物靶點選擇[17-18]。基于基因表達(dá)的CHD嚴(yán)重程度評分測試[19-21]已經(jīng)證明了其在評估CHD風(fēng)險、診斷和未來心臟事件方面的潛力。

2.1 DNA甲基化

DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶的過程，對DNA進(jìn)行直接化學(xué)修飾且不改變DNA序列，與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)[22-23]。心肌組織對表觀遺傳改變是最直接的證據(jù)，但獲取困難，可通過血液來觀察其變化。研究報道，通過5項隊列研究對40多萬血液DNA甲基化位點進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)505個表觀遺傳位點在不同隊列中的重疊，證實表觀遺傳生物學(xué)通路存在相互關(guān)聯(lián)，其中有19個差異甲基化磷酸鳥嘌呤位點與CHD正相關(guān)[24]。近期另一研究也發(fā)現(xiàn)，在歐美國家的人群中血液源性DNA的甲基化與未來CHD的風(fēng)險相關(guān)[25]。通過外周血細(xì)胞進(jìn)行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序分析，可預(yù)測CHD風(fēng)險，為治療提供決策、評估預(yù)后。

2.2 組蛋白修飾

組蛋白修飾包括組蛋白甲基化、乙酰化和泛素化、磷酸化途徑，在轉(zhuǎn)錄水平對CHD基因進(jìn)行靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控而影響CHD發(fā)生發(fā)展。有研究證實，組蛋白去乙?；?和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1進(jìn)行調(diào)節(jié)表達(dá)，與環(huán)境因素共同作用可調(diào)控CAD基因，使得CAD風(fēng)險增加，組蛋白和非組蛋白的乙?；殉蔀樾难芗膊★L(fēng)險共識[26-27]。

2.3 非編碼RNA調(diào)控

非編碼RNA參與基因調(diào)控和疾病發(fā)病機(jī)制。非編碼RNA中轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控、突變和單核苷酸多態(tài)性是心血管領(lǐng)域的研究前沿。動脈粥樣硬化是大部分CHD的基礎(chǔ)病變這一觀點已經(jīng)受到廣泛認(rèn)可。有研究表明，Nexilin F-肌動蛋白結(jié)合蛋白(nexilin F-actin binding protein，NEXN)是一種具有細(xì)胞黏附和遷移作用的肌動蛋白結(jié)合蛋白的編碼基因，其中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)NEXN-AS1通過TLR4/NF-κB介導(dǎo)途徑上調(diào)NEXN的表達(dá)，通過過表達(dá)負(fù)反饋抑制TLR4和NF-κB信號通路而實現(xiàn)減少內(nèi)皮細(xì)胞炎癥分子表達(dá)，抑制單核細(xì)胞募集，減緩動脈粥樣硬化發(fā)生[28]。

綜上所述，識別表觀遺傳有助于臨床應(yīng)用，可作為檢測表觀遺傳生物標(biāo)志物，為CHD高危人群進(jìn)行篩查診斷；其表觀遺傳可通過其修飾靶點進(jìn)行相關(guān)藥物干預(yù)。

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與CHD

轉(zhuǎn)錄組是由某個物種或特定細(xì)胞類型所產(chǎn)生的全部RNA的集合。關(guān)注轉(zhuǎn)錄后的總RNA，利用高通量測序技術(shù)，可揭示CHD的基因表達(dá)、結(jié)構(gòu)差異，闡明分子機(jī)制。2006年KURIMOTO等[29]從單細(xì)胞中全局?jǐn)U增mRNA，再到TANG等[30]的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)mRNA-seq，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序已得到廣泛開展。scRNA-seq已應(yīng)用于動脈粥樣硬化研究，可識別以前未被識別的細(xì)胞群[31-32]。目前單細(xì)胞水平分子研究已從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析擴(kuò)展到單細(xì)胞基因組研究。miRNAs在血液和尿液等生物液體中穩(wěn)定表達(dá)、lncRNA覆蓋的RNA分子超過200個核苷酸，在許多組織中均可表達(dá)[33]。lncRNA、miRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控與CAD發(fā)生發(fā)展有關(guān)。lncRNA ANRIL、miR-181b介導(dǎo)NF-κB信號通路，ANRIL通過靶向miR-181b控制CAD細(xì)胞的增殖和凋亡，從而誘導(dǎo)NF-κB信號通路的激活釋放多種炎性因子，促進(jìn)CAD的產(chǎn)生及發(fā)展[34]。先前全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)易致CHD發(fā)生的9p21染色體上的遺傳變異，也是由lncRNA ANRIL介導(dǎo)的，其基因與9p21基因組具有共同作用位點[35]。MORADI等[36]經(jīng)過人群病例對照研究驗證miR-10a調(diào)控NF-κB信號通路參與動脈粥樣硬化形成。同時，臨床研究表明RNA表達(dá)在CHD組冠狀動脈及體循環(huán)中高于非CHD組[37]。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)與CHD

隨著心血管蛋白質(zhì)組學(xué)研究突破及質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)展，無標(biāo)記蛋白質(zhì)組定量已廣泛應(yīng)用于CHD的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物研究[38]。在分子機(jī)制水平，數(shù)百種細(xì)胞內(nèi)、外蛋白的集合導(dǎo)致動脈粥樣硬化，共同改變細(xì)胞過程并特征性地重塑局部血管環(huán)境。最終，這些蛋白質(zhì)組水平上的改變導(dǎo)致了大多數(shù)缺血性心血管事件的發(fā)生[39]。

脂聯(lián)素是一種從脂肪細(xì)胞中釋放的激素，具有胰島素增敏和抗動脈粥樣硬化特性[40]。進(jìn)一步研究證實，吸煙者可引起血液中單個核細(xì)胞中的脂聯(lián)素mRNA水平降低[41]，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)錄因子與CHD關(guān)聯(lián)密切，TCF21編碼一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，該因子可促成冠狀動脈平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)的前體細(xì)胞遷移到血管病變中，并促進(jìn)纖維帽的形成，維持斑塊穩(wěn)定[42]。眾所周知，SMC可促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成。人類遺傳和基因組數(shù)據(jù)表明，TCF21表達(dá)可降低CAD風(fēng)險，心肌素-血清反應(yīng)因子[myocardin(MYOCD)-serum response factor(SRF)]是TCF21的下游通路，阻斷該通路起到抑制SMC分化的作用，其保護(hù)路徑在于TCF21與心肌蛋白直接互作，破壞MYOCD-SRF復(fù)合物，抑制SMC基因表達(dá)，以及與SRF在相同的位點上結(jié)合抑制SRF表達(dá)[43]。

5 代謝組學(xué)與CHD

代謝組即基因組下游參與機(jī)體新陳代謝、維持機(jī)體正常功能及生長發(fā)育，Mr常在1 000以內(nèi)。雖然代謝組學(xué)在不斷發(fā)展，CAD生物標(biāo)志物也相繼出現(xiàn)，但其功能機(jī)制尚未明確。功能代謝組學(xué)可將代謝組學(xué)衍生的生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)化為疾病機(jī)制[44]。在一項臨床研究中，以神經(jīng)氨酸酶-1對心肌損傷起到保護(hù)作用為切入口，其在心臟的異常激活可導(dǎo)致血漿Neu5Ac升高，Neu5Ac在CAD患者血漿中的表達(dá)顯著增加[44]。另一項研究顯示，通過新型基因、代謝網(wǎng)絡(luò)IPA，可揭示炎癥、胰島素和脂質(zhì)通路的基因與動脈粥樣硬化代謝標(biāo)志物的關(guān)系，表明動脈粥樣硬化中存在代謝紊亂，包括甘露糖、對乙酰氨基酚-葡萄糖醛酸、乳酸和載脂蛋白B等在內(nèi)的代謝物[45]。

6 空間組學(xué)與CHD

傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)并不能了解細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)、生物力學(xué)等對于細(xì)胞乃至信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式的影響?；跁r間與空間的組學(xué)研究，聯(lián)合生物信息學(xué)，可明確以上心血管疾病分子調(diào)控的功能與作用。雖然不同于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等得到普遍的開展，但空間組學(xué)在主動脈瓣鈣化病的研究中已得到驗證[46]。

DBiT-seq高分辨空間組學(xué)技術(shù)，可獲取單細(xì)胞測序技術(shù)無法涉及的細(xì)胞空間分布信息[47]?？臻g組學(xué)捕獲細(xì)胞空間特異性信息，還原組織中細(xì)胞相對位置關(guān)系，揭示細(xì)胞空間分布關(guān)系對疾病的影響。該技術(shù)的短板在于無法從組織切片上進(jìn)行空間表觀基因組測序，而高空間分辨率染色質(zhì)修飾狀態(tài)分析測序則提供了解決方案，這項空間表觀基因組測序技術(shù)，揭示了組織類型特異性的表觀遺傳調(diào)控，可進(jìn)行組織全基因組輪廓解讀[48]。以心血管疾病實驗常用動物(鼠)為例，明確實驗對象心肌細(xì)胞的位置關(guān)系。通過糅合空間多組學(xué)技術(shù)進(jìn)行組學(xué)深度挖掘，空間定位組學(xué)從基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同層面收集組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分子、細(xì)胞、微環(huán)境信息，揭示心血管疾病的關(guān)聯(lián)發(fā)病機(jī)制。目前針對新衍生出的空間組學(xué)在心血管領(lǐng)域的研究面尚未普及，但今后將有更大的研究前景。

7 多組學(xué)聯(lián)合分析

基因組學(xué)亟待解決的問題是明確基因組DNA序列，測序可明確編碼序列的異同。此外，RNA表達(dá)量、蛋白結(jié)構(gòu)與活性并不能通過基因序列來明確。遺傳學(xué)庫與陽性病理樣本不足也是掣肘基因及表型的關(guān)聯(lián)。此外，存在dsRNA介導(dǎo)RNAi由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，可在轉(zhuǎn)錄層面、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)存在的不足之處：BINGHAM等[49]研究指出，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、降解、翻譯和翻譯后修飾等過程，RNA與蛋白質(zhì)并非以1∶1的比例表達(dá)，因此，需通過蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)表達(dá)量、蛋白質(zhì)之間的相互作用及定位等，從而獲取轉(zhuǎn)錄后翻譯層面的生物學(xué)信息。蛋白質(zhì)組學(xué)中蛋白濃度、活性、同類蛋白補償效應(yīng)，均可能影響到研究結(jié)果，而代謝組學(xué)中小分子物質(zhì)則可彌補這種不足。

隨著各組學(xué)技術(shù)日臻成熟，CHD研究將趨向多組學(xué)聯(lián)合分析、多維度揭秘疾病機(jī)制，彌補各個組學(xué)之間的不足。當(dāng)前國內(nèi)外研究學(xué)者所開展的研究已經(jīng)體現(xiàn)多組學(xué)相互融合所發(fā)揮的作用[43，50-51]。多組學(xué)實驗研究的一項結(jié)果顯示，構(gòu)建CHD患者中頸動脈斑塊的mRNA表達(dá)譜，可識別出與易損斑塊相關(guān)的關(guān)鍵上調(diào)基因，并通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene coexpression network analysis，WGCNA)回歸構(gòu)建廣泛的成員基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。再通過WGCNA與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析相結(jié)合分析易損斑塊相關(guān)基因表達(dá)譜，從而識別斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞中促使易損斑塊形成的功能基因模塊，進(jìn)而明確基于miRNA調(diào)節(jié)導(dǎo)致動脈粥樣硬化的上游機(jī)制[52]。基于CHD疾病的多因素性，單一研究并不能很好解釋遺傳效應(yīng)及現(xiàn)象。因此，整合多組學(xué)對于CHD顯得尤為重要。

8 風(fēng)險預(yù)測

CHD基因組風(fēng)險評分將為CHD患病風(fēng)險提供評估與預(yù)測。隨著各組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，聯(lián)合多組學(xué)評估分析，將極大地協(xié)助CHD臨床診療。以往CHD大型研究表明，多基因高風(fēng)險和疾病風(fēng)險之間聯(lián)系緊密。近年來研究表明，早發(fā)性CHD多基因風(fēng)險評分優(yōu)于臨床風(fēng)險評分[53]。另一方面，有研究指出多基因風(fēng)險評分與CHD發(fā)病率顯著相關(guān)，但多基因風(fēng)險評分與臨床風(fēng)險評分對CHD事件的預(yù)測準(zhǔn)確性差異不大[54]。未來隨著遺傳研究的深入，基因風(fēng)險預(yù)測評估作用將更加顯著。已有的大型基因組研究提出，疾病風(fēng)險預(yù)測前瞻研究有益于早期預(yù)測發(fā)現(xiàn)患病的風(fēng)險，進(jìn)行超前性疾病篩查與干預(yù)[5，55]。基因測序在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)領(lǐng)域的普遍開展，以及疾病基因篩查，將進(jìn)一步降低CHD風(fēng)險。在不遠(yuǎn)的將來，CHD風(fēng)險預(yù)測及預(yù)防將成為精準(zhǔn)個體化治療的關(guān)鍵。