酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)發(fā)光法和熒光定量PCR法三種檢驗方式在丙型肝炎檢驗中的應(yīng)用進展

崔欲曉 天津市東麗區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗科 （天津 300300）

內(nèi)容提要： 丙型肝炎（hepatitis C，HC）是丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染所致的一種疾病，在臨床中主要表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、厭食、關(guān)節(jié)疼痛、乏力等，具有易反復(fù)、慢性化、傳染性等特點。酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、電化學(xué)發(fā)光法（electro-chemiluminescence immunoassay，ECLIA）和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（fluorescentquantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）是臨床較為常用的三種檢驗方式，目前其應(yīng)用于HC的研究也越來越多。因此，本文就近年來ELISA、ECLIA和FQ-PCR三種檢驗方式應(yīng)用于HC的現(xiàn)狀作一綜述，旨在為HC的臨床診治提供更多參考。

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）在全球感染率已達3.2%且逐年升高，研究顯示近80%患者可進展為丙型肝炎（hepatitis C，HC）[1]。HC治療難度較高，初期臨床癥狀不顯著，患者未得到及時治療很可能發(fā)展為肝癌，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一[2]。目前臨床常用的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）電化學(xué)發(fā)光法（electro-chemiluminescence immunoassay，ECLIA）和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）[3,4]，為HC的防治提供了重要的參考。因此，本文對近年來HC患者應(yīng)用ELISA、ECLIA和FQ-PCR進行展開綜述，旨在提高HC患者生存質(zhì)量。

1.檢驗方式

1.1 ELISA

ELISA敏感性和特異性均較高，但檢驗方式操作步驟較為復(fù)雜，且費用較高[5]。ELISA可分為間接法和雙抗原夾心法[6]，間接法的原理是采用HCV抗原對固體載體進行包被，通過辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）對被檢樣品抗-HCV反應(yīng)和抗人免疫球蛋白G（Immunoglobulin，IgG）進行標(biāo)記，待底物鄰苯二胺顯色，即采用酶標(biāo)儀判定結(jié)果的陰陽性[7]。間接法主要的反應(yīng)過程為：向已包被的抗原反應(yīng)孔中加入待測樣本進行孵育，若標(biāo)本中存在抗-HCV，則可與微孔抗原結(jié)合成為固相抗原抗體復(fù)合物；由于其他的免疫球蛋白和樣品雜志無法結(jié)合固相抗原，因而可被洗滌洗去；將酶結(jié)合物加入其中孵育后使得其連接于抗原抗體復(fù)合物，洗滌后，可在3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺底物（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB）參與的條件下出現(xiàn)顯色反應(yīng)，將終止液加入其中后，采用酶標(biāo)儀對結(jié)果進行測量分析。雙抗原夾心法的原理是借助純化的抗-HCV抗體對微孔板進行包被，再將HCV抗原的肽片段加入微孔中，隨后結(jié)合被HRP所標(biāo)記過的HCV抗原成為抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，徹底洗滌并加入TMB進行顯色，最后采用酶標(biāo)儀對結(jié)果進行判定[8]。雙抗原夾心法主要的反應(yīng)過程為：待樣本和試劑恢復(fù)到室溫后，向設(shè)置好的7個標(biāo)準(zhǔn)的樣品孔中依次加入不同稀釋比例的100μL標(biāo)品，而零孔中則加100μL的標(biāo)準(zhǔn)品，對酶標(biāo)板進行覆膜，在37°C下反應(yīng)2h，行去液和甩干處理后，再加入100μL檢測溶液1的工作液，于37°C反應(yīng)1h，將孔內(nèi)液體甩干后，在350μL洗滌液中浸泡1～2min，隨后進行3次充分洗滌，注意在洗滌的最后一次需完全甩干孔內(nèi)的洗滌液，在將100μL檢測溶液2的工作液加入孔內(nèi)，對酶標(biāo)板覆膜并于37°C反應(yīng)30min，在進行5次甩干和洗板操作，將90μL的底物溶液加入各孔，對酶標(biāo)板進行覆膜后在避光、37°C條件下進行顯色反應(yīng)，待充分顯色，即將終止液加入其中，最后采用酶標(biāo)儀判定結(jié)果。

孫強等[9]分別采用雙抗原夾心法和間接法對HCV抗體進行檢測，結(jié)果顯示兩者檢測的準(zhǔn)確率具有顯著的差異性，雙抗原夾心法和間接法均可有效檢測HCV抗體，但雙抗原夾心法的特異性、靈敏度更高。分析其可能原因：雙抗原夾心法能夠檢測IgG、免疫球蛋白M（Immunoglobulin，IgM）在內(nèi)的總抗體，同時IgG亞型不會影響反應(yīng)過程，對HCV感染窗口期的縮短有著重要的意義，進而提高早期感染的檢出率，并且雙抗原夾心法通過不同重組抗原對吖啶酯和生物素進行標(biāo)記，能夠減少非特異性的抗體和類風(fēng)濕因子干擾，降低假陽性率。

ELISA發(fā)生假陽性現(xiàn)象可能因素：①注液量未達到要求、抽吸不全等不符合標(biāo)準(zhǔn)的操作；②患者原發(fā)病中存在超氧化物歧化酶、高免疫蛋白、類風(fēng)濕因子等或血樣溶血；③試劑：酶結(jié)合物、所克隆抗體純度低于標(biāo)準(zhǔn)以及抗原不純。

1.2 ECLIA

ECLIA主要是由電化學(xué)所引發(fā)的特異效果而產(chǎn)生的一種化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在檢測中能夠自動稀釋和重新檢測[10]。ECLIA結(jié)合了高特異性免疫反應(yīng)和高度靈敏化學(xué)發(fā)光的測定技術(shù)，在臨床上廣泛應(yīng)用。通過競爭法對小分子的抗原進行檢測，夾心法對大分子的抗原進行檢測，非特異性的結(jié)合少；結(jié)合大分子后不影響光量產(chǎn)生，有利于提高靈敏度。ECLIA原理是通過聯(lián)吡啶釕對病原體抗體或抗原免疫反應(yīng)發(fā)生后的復(fù)合物進行標(biāo)記，借助電場作用中電子傳遞將激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)化為基態(tài)并發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光法屬于分子發(fā)光廣譜分析法中的一類，其主要依據(jù)化學(xué)檢測體系中待測物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理，通過儀器檢測待測物發(fā)光強度的痕量分析方法。除在臨床檢驗醫(yī)學(xué)中具有廣泛應(yīng)用外，在各類痕量金屬離子、無機化合物、有機化合物及生物領(lǐng)域也有較高應(yīng)用價值?；瘜W(xué)發(fā)光是某種物質(zhì)分子吸收化學(xué)能而產(chǎn)生的光輻射。任何一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都包括兩個關(guān)鍵步驟，即化學(xué)激發(fā)和發(fā)光。因此，一個化學(xué)反應(yīng)要成為發(fā)光反應(yīng)，必須滿足兩個條件：第一：反應(yīng)必須提供足夠的能量（170～300KJ/mol），第二，這些化學(xué)能必須能被某種物質(zhì)分子吸收而產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)，并且有足夠的熒光量子產(chǎn)率。所研究的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)大多為氧化還原反應(yīng)，且多為液相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

陳少彬等[11]分別采用ECLIA和ELISA對獻血者抗-HCV進行檢測，研究結(jié)果顯示，兩種檢測方法有著高度的一致性，而在靈敏度方面，ECLIA更高。ECLIA假陽性率較高的原因分析為：①干擾：在檢測過程中可能受類風(fēng)濕類等其他抗體干擾；②標(biāo)本狀態(tài)：標(biāo)本存在較多的纖維蛋白原、嚴(yán)重溶血、乳糜等。段金霞等[12]也在其相關(guān)研究中指出，ECLIA法對乙肝病毒的檢測效能較ELISA法更好，但相比之下，ECLIA法的檢測成本較ELISA法更高，或無法很好適應(yīng)患者的臨床需求。周明等[13]卻表示，ELISA、ECLIA均有其自身優(yōu)勢、劣勢，該研究中兩種檢測方式的檢出率、敏感度、特異度均無明顯差異，該學(xué)者建議可在充分結(jié)合臨床實際基礎(chǔ)上為不同患者選擇合理的檢測方法。

1.3 FQ-PCR

FQ-PCR作為一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是目前病毒核酸檢測的最靈敏的直接檢測手段，其在病毒載量很低時即可檢測出。其檢測最常用的是DNA結(jié)合染料SYBR Green Ⅰ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法。理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進入了平臺期。FQ-PCR的原理是將HCV編碼區(qū)高度保守的區(qū)域視作靶區(qū)域，對熒光探針和特異性的引物進行設(shè)計，通過一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增，進而對血漿或血清樣本HCV RNA進行定量檢測，而HCV RNA陽性和病毒量含量能夠表明病毒的存在及其傳染性強弱和復(fù)制的活躍程度，對抗HCV和HCV RNA變化進行動態(tài)觀察，能夠有效判斷HC預(yù)后以及評價其用藥的臨床療效。與其他醫(yī)學(xué)檢驗手段相比，F(xiàn)Q-PCR具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短等諸多優(yōu)勢，目前該技術(shù)在多種病原學(xué)檢測、免疫疾病或腫瘤疾病的診斷中均有積極意義。

郭杰等[14]采用FQ-PCR對HC病毒核酸進行定量檢測并評價其檢測性能，研究結(jié)果表明FQ-PCR能夠有效檢測HCV RNA，且其正確度、精密度、線性范圍、檢測限、抗干擾的能力等均在臨床要求以內(nèi)。劉麗[15]也在其相關(guān)研究中表示，與ELISA等常見檢測方法相比，F(xiàn)O-PCR的檢測效率更高、結(jié)果更加準(zhǔn)確。

FQ-PCR影響因素有：①保存：采用肝素抗凝標(biāo)本對HCV RNA進行檢測時，若Taq酶與樣本殘余肝素相結(jié)合即可引起Taq酶濃度的降低，對其活性產(chǎn)生了間接性的抑制作用，最終對PCR的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響；②前處理：HCV RNA PCR的擴增效果及準(zhǔn)確性與核酸的提取方法有著直接的聯(lián)系，而磁珠法可最大限度的減少核酸的丟失，進而使PCR反應(yīng)中存在盡可能多的核酸標(biāo)本；③其他：儀器設(shè)備的精密度、人員操作、環(huán)境的溫濕度等也可能會對結(jié)果準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，HCV的短期治療，例如直接抗病毒藥物治療，可引起HCV RNA的迅速降低，導(dǎo)致其低于試劑的檢測下限，引起假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，同時核酸檢測很容易被污染，則又會導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

2.小結(jié)及展望

目前檢測HCV的方法主要有ELISA、ECLIA和FQ-PCR，但其均具有一定的局限性，因此提示臨床可通過比較各種檢測方法的優(yōu)缺點，采用兩種及兩種以上檢驗方法以縮短檢驗的窗口期，降低漏診率、假陰性率等，最終提高HCV感染的初期確診率。另外HCV確認(rèn)的檢測成本較高，特別是核酸檢測，其對操作人員和實驗室的條件也有著較高的要求，大多數(shù)的實驗室陽性檢測結(jié)果報告只依賴于一次的初篩陽性實驗結(jié)果，而并未進行更高特異性的核酸或血清學(xué)確證實驗，故臨床因重視病毒學(xué)的檢測方案的建立和完善，開發(fā)出高效率、低成本的新的檢測試劑或方法，同時對資源較為有限的地區(qū)的HCV基因的分型技術(shù)、核酸定量檢測技術(shù)進行積極發(fā)展，進而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，以為HCV病原體的地域分布、耐藥位點的分布以及基因組的凈化等研究提供一定的科學(xué)參考數(shù)據(jù)。