肺泡灌洗生物標志物在兒童難治性支原體肺炎診斷中的研究進展

馬紅娟，白佳利，王慧，王麗紅*

(1.長治市婦幼保健院，山西 長治 046000；2.長治醫(yī)學院，山西 長治 046000)

兒童難治性支原體肺炎(RMPP)是兒科常見疾病，但其治療和診斷都具有一定難度，對兒童健康造成巨大危害。RMPP患兒病情進展迅速，不僅可以引起嚴重的肺內(nèi)外并發(fā)癥，而且病情遷延不愈。對于RMPP的診斷，首先是在確診肺炎支原體肺炎(MPP)的前提下，經(jīng)過大環(huán)內(nèi)酯類抗生素規(guī)律治療后患兒病情繼續(xù)加重及血清學相關檢查指標明顯異常的可考慮該病[1]。然而由于血清學相關檢查的滯后性及缺乏特異性，不能對RMPP進行早期診斷，易延誤診治，耽誤病情，給治療增加難度。RMPP的形成主要與患兒產(chǎn)生強烈的免疫應答及細胞因子反應有關[2]，相關生物標志物水平也隨之發(fā)生變化。因此，診斷RMPP、監(jiān)測RMPP進展、判斷RMPP預后的生物標志物受到廣泛關注。RMPP中有許多異常表達的生物標志物，在血清、痰液中檢測不敏感，缺乏特異性，標本易被污染。近年來，支氣管鏡已成為兒科呼吸疾病診治中安全、有效、不可缺少的手段，而通過支氣管鏡肺泡灌洗不僅可以避免標本污染，而且取樣范圍廣，被認為是目前肺炎病原學診斷更為敏感和可靠的方法[3]。因此采用肺泡灌洗生物標志物作為診斷指標能夠顯著提高敏感性和特異性，對疾病的早期診斷提供可能。

1 RMPP臨床表現(xiàn)和體征及影像學檢查的局限性

有關流行病學資料顯示：近年來，世界各地關于RMPP的報道增多，RMPP在各個年齡段兒童中均可發(fā)生，且發(fā)病年齡有減小趨勢[4-5]，所致的兒童病死率呈升高趨勢[6]。研究表明[7]，RMPP較普通MPP病情進展更快，有更嚴重的癥狀及體征，多伴有胸腔積液、肺不張、實變、胸膜增厚等表現(xiàn)。此外，還可引起各種肺外并發(fā)癥，累及多臟器，對兒童健康造成嚴重影響。但研究發(fā)現(xiàn)[8]，RMPP和MPP在咳嗽、呼吸困難等癥狀、體征上均無明顯差別，甚至RMPP患兒聽診喘鳴音比例低于MPP患兒，這提示僅依靠一般的臨床表現(xiàn)，無法實現(xiàn)對RMPP的早期診斷。另外，X線胸片也可無特征性表現(xiàn)，部分患兒早期還可以呼吸道外其他系統(tǒng)損傷的表現(xiàn)為首發(fā)癥狀，致早期誤診為其他疾病而延誤治療的最佳時機，使病情復雜化，嚴重者可危及患兒生命，因此，對RMPP進行早期診斷有重要意義[9]。

2 傳統(tǒng)診斷方法的局限性

RMPP是目前全球面臨的一個重要衛(wèi)生問題，臨床上各項實驗室檢查對其早期診斷有重要意義，其中肺炎支原體(MP)分離培養(yǎng)和血清學檢測由于其滯后性對RMPP的早期診斷意義不大，聚合酶鏈反應(PCR)特異性和敏感性強，不僅可以用于早期診斷，還可評估療效，但其對實驗室的條件要求較高，一般醫(yī)院實驗室難以滿足，尚未在臨床診斷中普遍應用[10]。RMPP主要是與機體免疫紊亂有關，研究其肺泡灌洗生物標志物已成為兒科領域的熱點。近年來，支氣管鏡已成為兒科呼吸疾病診治中安全、有效和不可缺少的手段，在病變部位進行支氣管肺泡灌洗，與血液、咽拭子等其他方式進行對比更直接、準確，MP陽性檢出率也高[11]。RMPP的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中各種生物標志物的表達有一定特點，觀察肺泡灌洗生物標志物變化有利于從不同生物學水平發(fā)現(xiàn)和預測RMPP。

3 肺泡灌洗生物標志物

隨著纖維支氣管鏡肺泡灌洗術在兒童難治性支原體肺炎中的廣泛應用，肺泡灌洗生物標志物成為研究熱點。與兒童RMPP診斷相關的生物標志物有白介素-4(IL-4)、γ-干擾素(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(CARDS Tx)的聯(lián)合高表達、白介素-17A(IL-17A)、半乳凝素-3(Gal-3)、可溶性B7-H3(sB7-H3)等。

3.1 IL-4和IFN-γ及IL-6

目前認為RMPP的發(fā)病機制主要與免疫紊亂有關，其中T細胞介導的免疫反應起到很重要的作用，主要表現(xiàn)為輔助型T細胞1(Thl)/輔助T細胞2(Th2)細胞因子表達的失衡。IFN-γ主要由Th1細胞產(chǎn)生，調(diào)節(jié)感染后人體的細胞免疫；IL-4主要由Th2細胞分泌，調(diào)節(jié)感染后人體的體液免疫反應。因此IFN-γ/IL-4代表機體Th1/Th2免疫功能平衡，此平衡的破壞與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。IL-6是一種主要由單核/巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生的促炎因子。據(jù)報道[12]，IL-6水平的增高是感染出現(xiàn)的最早炎性指標，且有研究證實[13]，IL-6也參與了細胞和體液免疫反應的過程，間接引起IFN-γ/IL-4水平的改變。

譚力等[14]通過分析47 例RMPP患兒和28 例支氣管異物患兒的BALF發(fā)現(xiàn)，RMPP患兒BALF中IL-4和IL-6及IFN-γ水平明顯升高，提示RMPP患兒病變局部炎癥反應明顯。相關研究發(fā)現(xiàn)[15]，RMPP急性期組BALF和血清中IFN-γ和IL-4及IL-6水平均明顯高于對照組和恢復期組，提示RMPP感染的急性期均可介導BALF和血清中細胞因子IFN-γ和IL-4及IL-6水平明顯升高，且通過受試者工作特征(ROC)曲線分析證實BALF中各指標對RMPP的診斷準確性均高于血清，尤其是IFN-γ/IL-4表現(xiàn)出對于RMPP的高度診斷價值。俞慧君等[16]通過回顧性分析難治性肺炎支原體肺炎和肺炎支原體肺炎的住院患兒各30 例的BALF，發(fā)現(xiàn)其中IFN-γ和IL-4水平均增高，且IFN-γ/IL-4越低越有助于早期識別RMPP。同時，BALF中IL-6水平對RMPP的診斷也有重要意義，且經(jīng)過治療后IL-6水平可下降，提示RMPP患兒BALF中IL-6水平與病情進展及嚴重程度相關，可為臨床早期診斷提供新思路。

3.2 TNF-α和社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素的聯(lián)合高表達

腫瘤壞死因子可分為TNF-α和TNF-β兩種，前者來自單核巨噬細胞，后者由活化T細胞產(chǎn)生，是具有重要生物活性的細胞因子。TNF-α是一種促炎因子，是各種免疫介導疾病的治療靶點之一。TNF-α可誘導中性粒細胞的趨化作用和局部浸潤、吞噬和殺傷病原體，從而啟動炎癥反應。適量的TNF-α對機體有保護作用，過量則引起免疫反應過度，引起局部甚至全身炎癥反應，嚴重者可致多系統(tǒng)損害。任勇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MPP患兒的TNF-α水平較健康兒童明顯增高，為早期診斷MPP提供可能。因此，探討RMPP患兒BALF中TNF-α的表達具有重要意義。社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(CARDS Tx)由MP產(chǎn)生，是一種具有ADP核糖基轉移酶和空泡化活性的毒力因子。既往認為MP無法分泌毒素，2005年Kannan等[18]通過研究MP與人表面活性蛋白的作用機制發(fā)現(xiàn)，MP可分泌MPN372毒力因子，2006年該毒素正式被命名為CARDS Tx。CARDS Tx本身還可誘導強烈的炎癥反應，Bose等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CARDS Tx可通過與NOD樣受體蛋白3(NLRP 3)炎癥體共定位和催化NLRP 3的腺苷二磷酸-核糖基化(ARL)而激活NLRP 3炎癥小體。NLRP 3炎癥體是一種經(jīng)過廣泛研究的炎癥復合體，可通過各種途徑引起機體嚴重炎癥反應。LI等[20]通過分析21 例RMPP患兒和50 例普通MPP患兒BALF的TNF-α和CARDS Tx毒素水平，發(fā)現(xiàn)RMPP患兒的TNF-α和CARDS Tx水平較對照組明顯升高，且71 例MPP患兒BALF中CARDS Tx毒素與TNF-α的表達呈正相關，提示高水平的CARDS Tx毒素可誘導TNF-α的表達，表明CARDS Tx毒素與TNF-α之間的潛在聯(lián)系及其在MPP中的致病作用。該研究為RMPP的早期診斷提供了新的證據(jù)，TNF-α的高表達可能是預測RMPP的一個很好的指標。

3.3 IL-17A

IL-17是一種可以誘導中性粒細胞分化和轉移的促炎因子，主要由Th17細胞產(chǎn)生。IL-17對于防止微生物入侵、感染蔓延有重要作用，主要表現(xiàn)為在吞噬細胞的形成中起重要作用和誘導各種免疫蛋白的產(chǎn)生[21]。有研究報道[22]，IL-17A通過誘導各種促炎因子和趨化因子，增強抗體產(chǎn)生，激活T細胞在早期免疫應答反應中起主要作用。研究發(fā)現(xiàn)[23]，與普通MPP兒童相比，RMPP患兒BALF中IL-17A的表達明顯降低，同時發(fā)現(xiàn)RMPP患兒中IL-17A的轉錄因子——孤核受體(ROR γτ)較普通MPP患兒和健康兒童都低，且通過比較RMPP患兒和普通患兒ROC曲線發(fā)現(xiàn)BALF中IL-17A高表達的可能性較低。因此，推測BALF中IL-17A的降低可能是診斷RMPP患兒的一個有價值的生物標志物，有助于RMPP的早期診斷。IL-17A在RMPP中的發(fā)病機制有待進一步研究，對RMPP的診斷和治療均有重要意義。

3.4 Gal-3

Gal-3是凝集素超級家族中的一個家族，廣泛分布于各種動物體內(nèi)，對β-半乳糖苷有特殊的親和力，在細胞黏附、細胞凋亡、炎癥反應、腫瘤轉移等許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。其中研究最多的是Gal-3，這是一種廣泛存在的具有多種生物學功能的蛋白質(zhì)，在自身免疫和免疫介導的炎癥疾病中發(fā)揮重要作用[24]。Gal-3是由肺部Clara細胞及巨噬細胞產(chǎn)生，它參與了中性粒細胞的激活和黏附、巨噬細胞的化學趨化等[25]。MP損害患兒下呼吸道，主要依賴巨噬細胞的吞噬作用清除，Gal-3通過刺激巨噬細胞活化而清除MP[26]。田芳等[27]研究發(fā)現(xiàn)，MPP患兒急性期血清中Gal-3水平升高，升高水平與病情的嚴重程度相關，表明Gal-3參與了MPP的炎癥反應，并反映病情嚴重程度，可作為病情評估的指標。趙茜葉等[28]研究也發(fā)現(xiàn)，RMPP患兒BALF中Gal-3水平急性期和恢復期均比對照組顯著增高，恢復期較急性期下降，但恢復至正常水平可能會需要至RMPP恢復期后一段時間。該研究還發(fā)現(xiàn)，RMPP患兒BALF中Gal-3水平與MP載量、中性粒細胞百分比呈明顯正相關，因此表明Gal-3參與RMPP氣道炎癥反應過程，并且與中性粒細胞趨化作用及浸潤密切相關。李俊利等[29]通過對比103 例RMPP患兒和30 例支氣管異物患兒的BALF發(fā)現(xiàn)，RMPP患兒的Gal-3、肺炎支原體載量、中性粒細胞及巨噬細胞水平顯著增高，RMPP急性期患兒的Gal-3、肺炎支原體載量、中性粒細胞水平與恢復期相比有顯著差異，故推測Gal-3在RMPP氣道炎癥中具有重要價值，其水平與肺炎支原體載量及中性粒細胞水平密切相關。因此推斷，患兒BALF中Gal-3水平檢測可作為RMPP早期診斷的指標之一。

3.5 可溶性B7-H3

B7-H3是新發(fā)現(xiàn)的共刺激分子B7家族的成員，是T細胞的輔助性刺激因子，目前B7-H3調(diào)控Th細胞分化仍存在爭議，B7-H3對T細胞有共刺激和共抑制兩方面的調(diào)節(jié)作用，既可促進IFN-γ，TNF-α和IL-6的分泌，也可抑制其分泌。B7-H3存在膜型B7-H3(mB7-H3)和sB7-H3兩種表達形式，單核細胞、樹突狀細胞、活化的T淋巴細胞上的mB7-H3在金屬蛋白酶剪切作用下可以脫落形成sB7-H3，能與活化的T細胞的B7-H3受體結合，參與外周免疫調(diào)節(jié)。

張新星等[30]研究發(fā)現(xiàn)，RMPP患兒急性期BALF中sB7-H3與IL-1β，IL-2，IL-36的表達都呈高水平，且sB7-H3水平與上述炎癥因子水平呈正相關，經(jīng)抗MP感染及感染后炎癥反應治療，BALF中sB7-H3，IL-1β，IL-2和IL-36的表達水平明顯降低。以此推測sB7-H3通過調(diào)控上述炎癥因子，參與MP感染后免疫反應及肺損傷，從而導致RMPP的發(fā)生及發(fā)展。梁利紅[31]研究發(fā)現(xiàn)，RMPP病患兒肺泡灌洗液sB7-H3較MPP患兒明顯升高，與上述結果一致。因此，sB7-H3可作為RMPP早期診斷的一個生物標志物。

4 結論及展望

RMPP診斷依賴多種因素，主要依臨床表現(xiàn)和血清學檢查進行判斷，但因其不典型性及滯后性，近年來肺泡灌洗生物標志物的研究成為熱點。雖然目前還不清楚這些生物標志物在RMPP中如何起作用，但識別這些生物標志物有助于更好地了解RMPP的炎癥進展情況及產(chǎn)生機制，從而為早期診斷RMPP提供思路。RMPP的早期診斷有助于早期干預治療，不僅可改善病情、縮短病程，而且是預防并發(fā)癥或后遺癥的關鍵。

隨著肺泡灌洗術的廣泛應用及研究，涉及RMPP的生物標志物越來越多，新的生物標志物逐漸被發(fā)現(xiàn)并用于RMPP的診斷，其中研究較多的有IL-4，IFN-γ，IL-6，TNF-α與CARDS Tx的聯(lián)合高表達及IL-17A，Gal-3，sB7-H3。RMPP患兒BALF中IFN-γ，IL-4，IL-6，TNF-α，CARDS Tx，Gal-3和sB7-H3水平病程初期均明顯增高，且其增高程度可能與疾病嚴重程度相關。RMPP患兒BALF中IL-17A水平、IFN-γ/IL-4較普通MPP患兒降低，且IFN-γ/IL-4越低越有助于早期識別RMPP。其中對早期識別RMPP最有效、臨床上應用較多的生物標志物可能是IFN-γ，IL-4和IL-6，為預防和治療RMPP提供新的思路。但這些生物標志物在臨床上應用的廣泛性和準確性仍有待提高，期望發(fā)現(xiàn)更多的肺泡灌洗生物標志物，從而在RMPP的早期診斷上取得突破。