紅棕櫚油中4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體的色譜分離條件優(yōu)化及含量測定

楊 歡，高 莉*，牛躍庭，Yoong Jun Hao，孫亞明，谷克仁，何麗君*

1.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450001 2．馬來西亞棕櫚油總署大馬棕櫚油技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司，上海 201108

紅棕櫚油是以紅棕櫚果肉為原料，經(jīng)壓榨和低溫分子蒸餾技術(shù)煉制而成的天然植物油，因其含有的胡蘿卜素較其他棕櫚油更高，故呈現(xiàn)紅棕色[1]。紅棕櫚油因富含胡蘿卜素而具有較高的營養(yǎng)價值，可以在預(yù)防維生素A缺乏癥[2-3]、眼部疾病[4]、心血管病[5]、癌癥[6-9]的同時，增強(qiáng)人體的抗氧化能力[10]，延緩衰老。胡蘿卜素和類胡蘿卜素是維生素A的前體[11]，因此對紅棕櫚油中胡蘿卜素的分離和檢測具有實(shí)用價值。除了對胡蘿卜素總量的定量檢測外，還需要從分子水平對其異構(gòu)體進(jìn)行分離和分析。

傳統(tǒng)的胡蘿卜素的測定方法主要有柱色譜法(CC)、薄層色譜法(TLC)[12]、紫外-可見分光光度法(UV-Vis)[13]、在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SFE-SFC-MS/MS)聯(lián)用法[14-16]、高效液相色譜法(HPLC)[17-20]等。其中CC法與TLC法樣品前處理操作復(fù)雜、耗時費(fèi)力，逐漸被其他先進(jìn)的分析方法取代。UV-Vis法局限于測定或估算復(fù)雜食品基質(zhì)中的胡蘿卜素總量，無法實(shí)現(xiàn)對胡蘿卜素同分異構(gòu)體的準(zhǔn)確定量分析。SFE-SFC-MS/MS法靈敏度高，但是儀器價格昂貴，且分析物對溫度和壓力敏感，無法得到推廣。HPLC法具有分析快速、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、可分離多種同分異構(gòu)體、實(shí)現(xiàn)自動化等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為胡蘿卜素定量分析方法中的主要手段。

目前未見針對紅棕櫚油中胡蘿卜素多種同分異構(gòu)體的同時分離檢測分析。作者采用HPLC分離技術(shù)，探討不同色譜條件(色譜柱種類、流動相種類、洗脫模式、流動相比例、流速、柱溫等)對α-胡蘿卜素、全反式-β-胡蘿卜素、13-順式-β-胡蘿卜素和9-順式-β-胡蘿卜素等4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體分離的影響，并在優(yōu)化色譜條件下，對紅棕櫚油中4種胡蘿卜素進(jìn)行定量檢測。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紅棕櫚油：馬來西亞棕櫚油總署大馬棕櫚油技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司。

氫氧化鉀(AR級)、抗壞血酸(AR級)、二氯甲烷(HPLC級):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷(AR級)：煙臺市雙雙化工有限公司；石油醚(沸程：30～60 ℃)、無水乙醇(AR級)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉(AR級)：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(AR級)：阿拉丁試劑(上海)有限公司；甲醇(HPLC級)、乙腈(HPLC級)：默克化工技術(shù)(上海)有限公司；α-胡蘿卜素、全反式-β-胡蘿卜素、13-順式-β-胡蘿卜素和9-順式-β-胡蘿卜素：上?；菡\生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計、LC-2040C 3D超高效液相色譜儀(配置PDA檢測器)：日本Shimadzu公司；InertSustain C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)：GL Sciences；Ultimate XB-C30色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)：Welch；C30色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)：YMC；BSA224S分析天平(0.000 1)：德國Sartorius公司；SHA-CA恒溫水浴振蕩器：上海華燕醫(yī)療器械有限公司；B-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D循環(huán)式多用真空泵：鄭州市鞏義華玉儀器廠；MTN-2800D氮吹儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取4種待測胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg和BHT 0.025 g，用二氯甲烷溶解并定容至10 mL，儲備液置于冰箱4 ℃保存。取適量儲備液，用二氯甲烷配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 μg/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品處理

紅棕櫚油實(shí)際樣品處理參照GB 5009.83—2016方法并稍加修改，主要包括油樣預(yù)處理、皂化和萃取3個步驟。稱取紅棕櫚油1.5 g，置于250 mL錐形瓶中，加入75 mL無水乙醇和1 g抗壞血酸，60 ℃恒溫水浴30 min。加入1 g/L氫氧化鉀溶液25 mL，蓋上瓶塞，53 ℃恒溫水浴30 min皂化。冷卻至室溫，將皂化液轉(zhuǎn)入500 mL分液漏斗中，加入100 mL石油醚，輕輕搖動，排氣，蓋上瓶塞，室溫振蕩10 min后靜置分層。將水相部分重復(fù)以上操作，合并有機(jī)相，水洗至中性，無水硫酸鈉干燥脫水。將濾液轉(zhuǎn)移至500 mL 蒸發(fā)瓶中，40 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干。隨后氮吹至干，移液器準(zhǔn)確加入5.0 mL二氯甲烷充分溶解提取物，過0.45 μm濾膜，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

分別掃描4種胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～800 nm的紫外-可見吸收光譜并比較差異，發(fā)現(xiàn)4種胡蘿卜素在450 nm處均有較強(qiáng)吸收，故選擇檢測波長為450 nm。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

考慮到4種胡蘿卜素異構(gòu)體結(jié)構(gòu)差別微小，難以分離，尤其是13-順式-β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素的分離以及全反式-β-胡蘿卜素與9-順式-β-胡蘿卜素的分離。因此先不考慮實(shí)際樣品基質(zhì)干擾，用4種胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化色譜條件。

2.1.2.1 InertSustain C18色譜柱

采用常規(guī)C18色譜柱，參照GB 5009.83—2016色譜分離條件，采用3%三氯甲烷/12%乙腈/85%甲醇，結(jié)果如圖1所示。在流速2.0 mL/min、柱溫35 ℃、等度洗脫條件下，隨著極性較弱的三氯甲烷含量的降低、極性較強(qiáng)的甲醇和乙腈含量的提高，色譜保留時間逐漸延長，分離度改善明顯，但是仍然只有3個色譜峰，無法實(shí)現(xiàn)4種胡蘿卜素的分離?？紤]到胡蘿卜素結(jié)構(gòu)中含有多個雙鍵，屬于典型疏水性化合物，因此改用疏水性更強(qiáng)的C30色譜柱。

注：峰1為13-順式-β-胡蘿卜素；峰2為α-胡蘿卜素；峰3為全反式β-胡蘿卜素；峰4為9-順式-β-胡蘿卜素。圖2—圖4同。圖1 InertSustain C18色譜柱對4種胡蘿卜素異構(gòu)體色譜分離條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of chromatographic separation conditions of four carotene isomers by InertSustain C18 column

2.1.2.2 Welch Ultimate XB-C30色譜柱

在2.1.2.1中較優(yōu)色譜條件下，改用Welch Ultimate XB-C30色譜柱，4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體分離效果顯著改善，實(shí)現(xiàn)初步分離，但是全反式-β-胡蘿卜素與9-順式-β-胡蘿卜素之間的分離度有待進(jìn)一步提高。首先嘗試降低流速，結(jié)果如圖2a所示，流速從2.0 mL/min降為1.5mL/min或1.0 mL/min，胡蘿卜素的分離度明顯改善，但是保留時間延長至45 ～ 67 min，柱效明顯降低，故而流速仍保持2.0 mL/min。接著優(yōu)化洗脫模式，嘗試了一系列梯度洗脫程序(表1)，結(jié)果如圖2b所示，全反式-β-胡蘿卜素與9-順式-β-胡蘿卜素色譜峰始終有部分重疊，無法實(shí)現(xiàn)完全分離。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

考慮到乙腈的極性介于三氯甲烷和甲醇之間，可以起到微調(diào)的作用，嘗試改變流動相中乙腈用量。如圖2c—2d所示，在相同梯度洗脫模式下，分別固定甲醇或三氯甲烷含量不變，同時改變乙腈/三氯甲烷(表2)或乙腈/甲醇(表3)的比例，胡蘿卜素保留時間發(fā)生相應(yīng)改變，但是分離效果改善不明顯，需要繼續(xù)微調(diào)流動相的極性。

注：a為流動相3%三氯甲烷/12%乙腈/85%甲醇，柱溫35 ℃；b、c、d為流速2.0 mL/min，柱溫35 ℃，其他條件見表1—表3。圖2 Welch Ultimate XB-C30色譜柱對4種胡蘿卜素異構(gòu)體色譜分離條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of chromatographic separation conditions of four carotene isomers by Welch Ultimate XB-C30 column

表2 改變乙腈/三氯甲烷比例時的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure by changing acetonitrile/chloroform ratio

表3 改變乙腈/甲醇比例時的梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedure by changing acetonitrile/methanol ratio

一方面，考慮到水的極性比甲醇和乙腈更大,嘗試流動相中加入少量水以期改變微小極性實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物分離，結(jié)果表明保留時間相應(yīng)延長，但分離效果未見明顯改善，且當(dāng)水的含量增大至5% (0.5% 三氯甲烷/20%乙腈/74.5%甲醇/5%水，等度洗脫，流速2.0 mL/min，柱溫35 ℃) 時,流動相的極性明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致具有疏水性的胡蘿卜素?zé)o法被洗脫。 加水無法改善色譜分離效果，故后續(xù)試驗(yàn)流動相中不再添加水。另一方面，考慮到二氯甲烷的極性比三氯甲烷更弱，嘗試用二氯甲烷替換流動相中的三氯甲烷，結(jié)果表明其對柱效及分離效果與三氯甲烷基本相同，而三氯甲烷毒性更大，故后續(xù)試驗(yàn)采用二氯甲烷作為流動相。綜合考慮分析時間和4種胡蘿卜素異構(gòu)體的分離度，較優(yōu)的色譜條件及色譜圖分別見表3 d-4和圖2 d-4，但是，期望能在更短時間內(nèi)對4種胡蘿卜素異構(gòu)體達(dá)到更好分離效果。

2.1.2.3 YMC C30色譜柱

在2.1.2.2中較優(yōu)色譜條件下，將Welch Ultimate XB-C30色譜柱換作YMC C30色譜柱，4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體能實(shí)現(xiàn)完全分離(圖3a)，且分析時間更短，說明YMC C30色譜柱對胡蘿卜素異構(gòu)體有更高的分離選擇性。但是分析時間還需近25 min，柱效也較低，需進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，以縮短保留時間，提高柱效。對二氯甲烷起始用量進(jìn)行調(diào)整，結(jié)果如圖3b所示，在固定乙腈含量不變的條件下，二氯甲烷含量由20%增至30%，保留時間顯著減小，4種胡蘿卜素色譜峰保留時間均小于15 min，且流動相無須使用梯度程序，等度洗脫即可，但分離度隨二氯甲烷含量增加而下降，尤其是13-順式-β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素。由圖3b可知，4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品的最佳色譜分離條件：YMC C30色譜柱，流動相20%二氯甲烷/3%乙腈/77%甲醇(等度洗脫模式，流速2.0 mL/min),柱溫35 ℃。

注：a的梯度洗脫程序見表3d-4，流速2.0 mL/min,柱溫35 ℃；b為等度洗脫，流速2.0 mL/min,柱溫35 ℃。圖3 YMC C30色譜柱對4種胡蘿卜素異構(gòu)體色譜分離條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of chromatographic separation conditions of four carotene isomers by YMC C30 column

2.1.3 實(shí)際樣品的色譜條件優(yōu)化

在2.1.2.3中最佳色譜分離條件下，對紅棕櫚油實(shí)際樣品中的4種胡蘿卜素進(jìn)行色譜分離。結(jié)果如圖4a所示，雖然實(shí)現(xiàn)了4種胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的完全分離，但由于紅棕櫚油實(shí)際樣品基質(zhì)的干擾，無法實(shí)現(xiàn)4種胡蘿卜素的完全分離，需要進(jìn)一步探索色譜分離條件。調(diào)控流動相的種類以及比例，保留時間發(fā)生了改變，但胡蘿卜素與基質(zhì)間的分離效果未能得到明顯改善。

嘗試調(diào)控柱溫和流速以增大4種胡蘿卜素的分離度，結(jié)果如圖4b所示。在相同流動相條件下，隨著柱溫的升高，色譜峰的峰形及保留時間發(fā)生較大改變，說明柱溫對紅棕櫚油實(shí)際樣品的色譜分離影響顯著，且柱溫低有利于分離。柱溫25 ℃條件(YMC C30色譜柱，流動相15%二氯甲烷/15%乙腈/70%甲醇，等度洗脫模式)下，流速從1.5 mL/min降至1.2 mL/min，實(shí)現(xiàn)了紅棕櫚油實(shí)際樣品中4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體的完全分離。但是此條件下，色譜峰展寬，柱效較低。通過增大疏水性較強(qiáng)的二氯甲烷含量，同時減小極性甲醇含量，達(dá)到了縮短保留時間、改善柱效的目的。最終優(yōu)化的紅棕櫚油中4種胡蘿卜素的色譜分離條件：YMC C30色譜柱，流動相20.5%二氯甲烷/15%乙腈/64.5%甲醇(等度洗脫，流速1.2 mL/min)，柱溫25 ℃。

注：a為相同色譜條件(YMC C30色譜柱，流動相20%二氯甲烷/3%乙腈/77%甲醇(等度洗脫，流速2 mL/min),柱溫35 ℃)下，紅棕櫚油實(shí)際樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜分離效果對比；b為紅棕櫚油實(shí)際樣品優(yōu)化色譜條件過程。圖4 紅棕櫚油實(shí)際樣品中4種胡蘿卜素異構(gòu)體色譜分離條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of chromatographic separation conditions for four carotene isomers in actual samples of red palm oil

2.2 方法性能評價

在最終優(yōu)化色譜條件下，對方法的性能進(jìn)行了考察，包括線性范圍(LR)、決定系數(shù)(R2)和檢出限(LOD，S/N=3)，結(jié)果如表4所示。4種胡蘿卜素異構(gòu)體在0.2～3.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，R2為0.999 6～0.999 9，LODs為0.01 μg/mL。

對紅棕櫚油樣品中的待測胡蘿卜素進(jìn)行提取，采用最優(yōu)色譜條件分離，得到4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體的色譜圖，以保留時間定性，測定實(shí)際樣品濃度，重復(fù)測定3次，結(jié)果如表4所示。紅棕櫚油實(shí)際樣品中13-順式-β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、全反式-β-胡蘿卜素和9-順式-β-胡蘿卜素的含量分別為16.9、40.2、42.9和5.1 mg/kg，紅棕櫚油實(shí)際樣品中胡蘿卜素總含量為105.1 mg/kg，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為0.9%～5.3% (n= 3)，表明該分析方法能成功用于4種胡蘿卜素的分離檢測。

表4 方法性能評價及紅棕櫚油中4種胡蘿卜素異構(gòu)體的定量檢測結(jié)果Table 4 Evaluation of the performance of the method and quantitative determination results of four carotene isomers in red palm oil

2.3 回收率和精密度試驗(yàn)

對紅棕櫚油樣品中的待測胡蘿卜素進(jìn)行提取，最優(yōu)色譜條件下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。選擇2個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)，結(jié)果如表5所示，4種胡蘿卜素的加標(biāo)回收率為91.0%～116.0%，RSDs為2.3%～8.5%(n= 5)，重復(fù)性良好。

表5 紅棕櫚油樣品中4種胡蘿卜素異構(gòu)體的加標(biāo)回收率Table 5 Spiked recoveries of four carotene isomers in red palm oil samples

3 結(jié)論

按照GB 5009.83—2016中油樣處理方法，將紅棕櫚油進(jìn)行預(yù)處理、皂化和胡蘿卜素萃取，進(jìn)行了HPLC色譜條件優(yōu)化，考察了色譜柱、流動相種類、流動相比例、流速、柱溫等影響因素，實(shí)現(xiàn)紅棕櫚油中4種胡蘿卜素異構(gòu)體(α-胡蘿卜素、全反式-β-胡蘿卜素、13-順式-β-胡蘿卜素、9-順式-β-胡蘿卜素)的完全分離。在最優(yōu)色譜條件(YMC C30色譜柱，流動相20.5%二氯甲烷/15%乙腈/64.5%甲醇(等度洗脫模式,流速1.2 mL/min),柱溫25 ℃)下，考察了HPLC方法的性能，并對紅棕櫚油實(shí)際樣品中4種胡蘿卜素異構(gòu)體含量進(jìn)行了測定。4種胡蘿卜素在0.2～3.0 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R2= 0.999 6～0.999 9)，LODs為0.01 μg/mL，加標(biāo)回收率為91.0%～116.0%，RSDs為2.3%～8.5%(n= 5)。結(jié)果表明，優(yōu)化的HPLC方法能成功用于紅棕櫚油中4種胡蘿卜素同分異構(gòu)體的分離檢測，在紅棕櫚油品質(zhì)分析中具有較大的應(yīng)用潛力。但試驗(yàn)過程中存在胡蘿卜素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，受熱、見光、遇氧氣易降解以及實(shí)際油樣基質(zhì)復(fù)雜等干擾，在萃取、保存等過程中需高度關(guān)注。