乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓汁工藝優(yōu)化及功能特性研究

張晨顏，張麗霞*，魏照輝，周存山

1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014

藍(lán)莓(Vacciniumspp.)系杜鵑花科、越橘屬多年生灌木小漿果果樹(shù)，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，果肉細(xì)膩、甜酸適度，享有“水果中的皇后”之美稱，富含花青素、黃酮醇、酚酸等多種活性成分。藍(lán)莓主要分布于北半球的溫帶和亞熱帶，我國(guó)的主要產(chǎn)區(qū)為東北大興安嶺、山東、江蘇、貴州和浙江等[1]。田密霞等[2]對(duì)60種藍(lán)莓果的花青素含量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)花青素平均含量可達(dá)5.378 mg/g。藍(lán)莓花青素具有抗炎癥[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]等多種生物活性。白沙沙等[7]利用高效液相色譜法檢測(cè)出藍(lán)莓花青素的優(yōu)勢(shì)單體為矢車菊色素和芍藥色素。乳酸菌是一種益生菌，具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、維持腸道菌群平衡、改善免疫力等功能[8]。李虹甫[9]利用植物乳桿菌LJ26發(fā)酵藍(lán)莓果汁，其活菌數(shù)達(dá)1×109CFU/mL；乳酸菌發(fā)酵能夠提高桑葚汁中總花青素、酚類和類黃酮的含量，發(fā)酵后其清除DPPH自由基能力明顯增強(qiáng)[10]。

我國(guó)藍(lán)莓的加工利用起步較晚，開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品比較單一，深加工技術(shù)的滯后已成為其產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。乳酸菌發(fā)酵被認(rèn)為是最有效的保持與提高果蔬營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味的處理方式。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外乳酸菌發(fā)酵果汁及其產(chǎn)品研發(fā)呈現(xiàn)加快趨勢(shì)，主要集中在單一菌種的發(fā)酵工藝優(yōu)化方面。乳酸菌發(fā)酵型藍(lán)莓汁是一種新興飲料，在改善藍(lán)莓風(fēng)味的同時(shí)，還大大提高了其利用率。但目前對(duì)于乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓汁的技術(shù)要求尚不明確，且在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌的生長(zhǎng)易受環(huán)境影響，優(yōu)化發(fā)酵工藝是藍(lán)莓汁發(fā)揮益生作用的重要前提。目前，乳酸菌發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓汁抗氧化酶活、花青素單體組分與含量的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

作者選用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌為發(fā)酵菌種制備藍(lán)莓汁，以超氧化物歧化酶(SOD)活力為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。比較分析藍(lán)莓汁發(fā)酵過(guò)程中總酚、花青素、總糖含量、SOD酶活及活菌數(shù)的變化，研究藍(lán)莓汁發(fā)酵前后抗氧化活性，對(duì)花青素單體組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為藍(lán)莓的資源開(kāi)發(fā)及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓鮮果：句容市藍(lán)莓種植基地；苯酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過(guò)硫酸鉀、福林酚、沒(méi)食子酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、SOD酶活力檢測(cè)試劑盒：上海源葉生物科技有限公司；SH-470乳酸菌：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所401實(shí)驗(yàn)室保藏；L(+)- 抗壞血酸(VC)：西隴科學(xué)股份有限公司；果膠酶：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：金壇市恒豐儀器制造有限公司；FE-20 pH計(jì)：梅特勒托利多(上海)有限公司；L18-Y22多功能榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；XFS-280高壓蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-150AE生化培養(yǎng)箱：上海坤權(quán)生物科技有限公司；1260高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓汁制備與菌種活化

藍(lán)莓汁的酶解[11]：取新鮮藍(lán)莓果、清洗、打漿后添加0.1%果膠酶，置于50 ℃水浴鍋中酶解1 h，5 000 r/min離心15 min，并用NaHCO3調(diào)節(jié)pH值為4.50，85 ℃殺菌15 min，冷卻至室溫后備用。乳酸菌活化[12]：將乳酸菌凍干粉接種于10%滅菌脫脂乳，37 ℃活化一定時(shí)間備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

將藍(lán)莓汁接入活化的乳酸菌，考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、蔗糖添加量對(duì)SOD酶活性和乳酸菌活菌數(shù)的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考慮到發(fā)酵時(shí)間間隔較短，活菌數(shù)計(jì)數(shù)誤差大、準(zhǔn)確度低，最終以SOD酶活性為響應(yīng)值，以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量和蔗糖添加量為影響因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.4 總糖含量測(cè)定

參考潘葳等[13]的方法并稍做修改，吸取1 mL稀釋后的發(fā)酵藍(lán)莓汁于試管中，依次加入1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸后搖勻，70 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總糖含量。

1.3.5 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定總酚含量[14]。

1.3.6 花青素含量測(cè)定

參考Wrolstad等[15]的方法使用pH示差法測(cè)量藍(lán)莓汁中總花青素含量。

式中：花青素含量以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)；D=D1-D2(D1=D2=D(520)-D(700)，D1為pH 1.0條件下測(cè)得，D2為pH 4.5條件下測(cè)得)；Mr為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2；DF為稀釋倍數(shù)；V為測(cè)定溶液體系體積，mL；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/(mol·cm)；L為光程(1 cm)。

1.3.7 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)。

1.3.8 SOD酶活性測(cè)定

SOD酶活性根據(jù)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。SOD酶活性是指在反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為1個(gè)SOD活力單位(U)。將稀釋后的樣品于37 ℃水浴40 min，提前預(yù)熱以便后續(xù)檢測(cè)。在反應(yīng)體系中加入10 μL預(yù)熱至37 ℃的樣品，再加入10 μL顯色劑，以蒸餾水為空白對(duì)照，混勻后于37 ℃孵育20 min，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光值。

SOD酶活力(U/mL)=

式中：A、B、C分別為對(duì)照、測(cè)定、空白樣品的吸光度。

1.3.9 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

1.3.9.1 DPPH清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16-17]的方法并稍做修改。以VC為對(duì)照標(biāo)樣，測(cè)定體系中包含2 mL樣品溶液和2 mL 0.1 mmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液并記為A1?？瞻左w系中用蒸餾水代替樣品記為A0。對(duì)照組不加顯色劑，記為A2。

1.3.9.2 ·OH清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn) [18]的方法并稍做修改。以VC為對(duì)照標(biāo)樣，測(cè)定體系中包含3 mL不同濃度樣品溶液、0.5 mL 0.9 mmol/L FeSO4、0.5 mL 0.9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液并記為A1?？瞻左w系中以蒸餾水代替樣品并記為A0。對(duì)照組不加顯色劑，記為A2。

1.3.9.3 ABTS+清除率測(cè)定

參考Amoussa等[16]的方法并稍做修改。以VC為對(duì)照標(biāo)樣，測(cè)定體系中包含2 mL ABTS工作液和2 mL不同濃度樣品溶液并記為A1。空白體系中以蒸餾水代替樣品并記為A0。對(duì)照組不加ABTS工作液，記為A2。

1.3.10 高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)花青素含量

參照Z(yǔ)hang等[19]的方法，經(jīng)HPLC檢測(cè)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=9.628 5x+69.654(R2=0.997 6)，y表示峰面積，x表示矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度。藍(lán)莓汁樣品經(jīng)5 000 r/min離心15 min，取上清液，過(guò)0.45 μm膜進(jìn)樣檢測(cè)。樣品檢測(cè)結(jié)果均表示為每毫升藍(lán)莓汁中的當(dāng)量矢車菊素-3-O-葡萄糖苷微克數(shù)(μg/mL)。

1.3.11 高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)鑒定花青素組分

參照Chai等[20-21]的方法鑒定花青素組分。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用 Excel 2010 和SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，并用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活力和活菌數(shù)的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵36 h達(dá)到最大值，為2.69×1010CFU/mL，發(fā)酵48 h時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)為1.19×1010CFU/mL。SOD酶活力呈現(xiàn)先增加后顯著降低趨勢(shì)，發(fā)酵24 h時(shí)SOD酶活力達(dá)到最大值，為258.82 U/mL，隨后迅速下降。發(fā)酵48 h時(shí)，SOD酶活僅為158.04 U/mL。綜合考慮，選擇24 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

注：不同小寫(xiě)字母表示活菌數(shù)差異顯著(P < 0.05)；不同大寫(xiě)字母表示SOD酶活差異顯著(P < 0.05)。圖2—圖4同。圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活性和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活性和活菌數(shù)的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，活菌數(shù)不斷增加，超過(guò)39 ℃時(shí)，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)楫?dāng)溫度超過(guò)乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度，加速了菌種衰老，導(dǎo)致活菌數(shù)下降。發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，SOD酶活力達(dá)到最高，為255.63 U/mL。溫度為41 ℃時(shí)，SOD酶活力僅為177.21 U/mL。由此可見(jiàn)，發(fā)酵溫度偏高或者偏低，都會(huì)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響，最終導(dǎo)致活菌數(shù)下降以及SOD酶活降低，這與白琳等[22]的研究結(jié)果基本一致。綜合考慮，選擇37 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活性和活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of lactic acid bacteria fermentation temperature on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.1.3 發(fā)酵接種量對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活性和活菌數(shù)的影響

由圖3可知，隨著乳酸菌接種量增加，活菌數(shù)呈略微增加趨勢(shì)。當(dāng)乳酸菌接種量過(guò)多時(shí)，藍(lán)莓汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足過(guò)量乳酸菌生長(zhǎng)需求[23]，反而導(dǎo)致活菌數(shù)降低。當(dāng)乳酸菌接種量由0.02%增加到0.10%時(shí)，SOD酶活力迅速增加，并達(dá)到最大(260.49 U/mL)。當(dāng)菌種接種量高于0.10%時(shí)，隨著接種量增加，菌種密度過(guò)于飽和從而快速發(fā)酵，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)多，且有機(jī)酸含量增加[24]，致使發(fā)酵液中SOD酶活力下降。綜合考慮，選擇0.1%作為最佳乳酸菌接種量。

圖3 乳酸菌接種量對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活性和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.1.4 蔗糖添加量對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活性和活菌數(shù)的影響

由圖4可知，隨著蔗糖添加量的不斷增加，乳酸菌活菌數(shù)和SOD酶活性均呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖添加量為6%時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)顯著增加，SOD酶活力也顯著增加，乳酸菌處于適宜的發(fā)酵環(huán)境條件下，發(fā)酵效果明顯增強(qiáng)。此時(shí)，活菌數(shù)最高，SOD酶活最高(260.24 U/mL)。當(dāng)蔗糖添加量高于6%時(shí)，由于果汁的滲透壓增加，超過(guò)乳酸菌對(duì)滲透壓的抵抗能力，過(guò)高的糖含量抑制了菌種生長(zhǎng)和代謝，不利于乳酸菌的生長(zhǎng)[25]。綜合考慮，選擇蔗糖的最佳添加量為6%。

圖4 蔗糖添加量對(duì)藍(lán)莓汁SOD酶活性和活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of sucrose addition on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，以SOD酶活力(Y)為指標(biāo)，A發(fā)酵時(shí)間、B發(fā)酵溫度、C乳酸菌接種量和D蔗糖添加量為影響因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of Box-Behnken test

利用 Design-expert 8.0.5 Trial 數(shù)據(jù)處理軟件中 ANOVA 程序?qū)Ρ?進(jìn)行二次回歸分析，可得回歸方程(模型)：

Y=261.47-1.60A+5.95B-5.50C-1.48D-27.79AB-37.96AC+3.49AD+1.16BC+0.48BD-7.00CD-25.67A2-32.04B2-25.97C2-30.27D2。

由表2可知，模型極顯著(P<0.000 1)，且R2>0.9，失擬項(xiàng)F檢驗(yàn)不顯著(P>0.05)，回歸方程擬合度好。二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2和交互項(xiàng)AB、AC、CD對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，其他交互項(xiàng)均不顯著(P>0.05)。表明各因素對(duì)抗氧化酶活力的影響呈二次關(guān)系，且4個(gè)因素之間存在交互作用。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance of response surface test results

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)所得回歸方程進(jìn)行逐步回歸，確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間23.38 h、發(fā)酵溫度37.21 ℃、接種量0.1%、蔗糖添加量5.97%，此時(shí)發(fā)酵藍(lán)莓汁的SOD酶活力預(yù)測(cè)值為262.04 U/mL，為了便于實(shí)際操作，將發(fā)酵工藝參數(shù)修改為發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量0.1%、蔗糖添加量6%，在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，發(fā)酵藍(lán)莓汁的SOD酶活力為261.63 U/mL，活菌數(shù)為2.18×1011CFU/mL，與模型預(yù)測(cè)值較一致，驗(yàn)證模型可靠，回歸方程可用于實(shí)踐中。

2.4 乳酸菌發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓汁營(yíng)養(yǎng)功能的影響

由表3可知，藍(lán)莓汁經(jīng)發(fā)酵后含糖量顯著降低，總酚和花青素含量顯著增加。這可能是發(fā)酵過(guò)程中大分子酚類物質(zhì)在乳酸菌釋放的水解酶類作用下被分解為小分子的酚類物質(zhì)。同時(shí)，一些與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合的酚類物質(zhì)也被釋放出來(lái)[26]。發(fā)酵后的藍(lán)莓汁抗氧化活性高于鮮榨果汁，其DPPH自由基清除率達(dá)到99.40%，高于VC。發(fā)酵后藍(lán)莓汁對(duì)ABTS+和·OH自由基清除率顯著增加(P< 0.05)，這可能是與發(fā)酵藍(lán)莓汁的總酚和總花青素含量增加有關(guān)[27]。包怡紅等[28]對(duì)藍(lán)靛果米糠酵素中總酚和抗氧化活性進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示總酚含量越高，其清除自由基能力也越強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致。

表3 乳酸菌發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓汁營(yíng)養(yǎng)功能的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria fermentation on nutritional function of blueberry juice

2.5 乳酸菌發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓汁花青素單體的影響

采用HPLC-MS檢測(cè)發(fā)酵藍(lán)莓汁花青素單體的含量及成分，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，藍(lán)莓汁中主要含有13種花青素單體。主要成分峰10(tR=28.74 min)在m/z493.1和331出現(xiàn)片段離子，由此推斷為錦葵色素衍生物，中性碎片162的丟失與己糖分子量符合。據(jù)文獻(xiàn)[29]報(bào)道，推測(cè)峰10為錦葵色素-3-O-半乳糖苷。峰3(tR=23.394 min)的分子離子峰為m/z449.2，碎片離子為m/z287，是由m/z449失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)為162的中性碎片而形成。132正是五碳糖(150)和花青素成苷時(shí)失去1分子水時(shí)的質(zhì)量數(shù)，和峰1的花色苷一樣，只有1個(gè)糖時(shí)，成苷位置在3位，據(jù)此推測(cè)峰3為矢車菊素-3-O-半乳糖苷。

表4 藍(lán)莓汁發(fā)酵過(guò)程中花青素單體成分和含量分布Table 4 Composition and content distribution of anthocyanin monomer during blueberry juice fermentation

將這些花色苷的分子離子峰及碎片離子與花青素標(biāo)準(zhǔn)樣品及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照，鑒定出峰10、峰3和峰13分別為錦葵色素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷和錦葵色素-3-O-葡萄糖苷。以此類推，峰1—2、峰4—9，峰11—12依次被鑒定，如表4所示。3種含量相對(duì)較高的花青素單體成分為錦葵色素-3-O-半乳糖苷(50.99 μg/mL)、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷(22.69 μg/mL)和矢車菊素-3-O-半乳糖苷(11.94 μg/mL)。

由表4可知，乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓汁過(guò)程中，單體花青素組分種類未發(fā)生變化，但單體花青素含量顯著變化。其中，有6種單體花青素組分含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，有4種單體花青素組分含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，有3種單體花青素組分含量呈現(xiàn)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加趨勢(shì)。含量相對(duì)最高的花青素單體成分錦葵色素-3-O-半乳糖苷(tR=28.740 min)含量顯著增加，發(fā)酵前含量為50.99 μg/mL，發(fā)酵24 h時(shí)含量達(dá)最大值(59.59 μg/mL)，與發(fā)酵前相比增加16.87%，發(fā)酵28 h后呈下降趨勢(shì)。其他兩種主要成分錦葵色素-3-O-葡萄糖苷(tR=31.006 min)和矢車菊素-3-O-半乳糖苷(tR=23.394 min)，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)含量顯著降低，發(fā)酵前含量分別22.69、11.94 μg/mL，發(fā)酵48 h時(shí)僅為17.00、8.14 μg/mL，分別為發(fā)酵前的74.92%、68.17%。Nie等[30]用干酪乳桿菌、鼠李乳桿菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵藍(lán)莓漿，并探究了發(fā)酵藍(lán)莓中花青素含量和結(jié)構(gòu)變化，發(fā)酵后的藍(lán)莓中花青素含量降低，藍(lán)莓中的?；吞腔潭认鄬?duì)較低(均為3-O-單糖苷)，花青素的丟失也可能是由于這種輕微的?；吞腔?。

相反，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(tR=24.797 min)和矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷(tR=26.370 min)的含量隨發(fā)酵延長(zhǎng)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，發(fā)酵28 h時(shí)分別為2.29、9.22 μg/mL。Zhang等[31]利用植物乳桿菌J26對(duì)藍(lán)莓汁發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后藍(lán)莓汁中花青素含量增加，推測(cè)花青素含量增加是由植物乳桿菌J26的生物轉(zhuǎn)化引起的，乳酸菌產(chǎn)生的酶能將復(fù)雜的類黃酮物質(zhì)分解成更簡(jiǎn)單的化合物。在發(fā)酵桑葚汁中也有相似的結(jié)果，發(fā)酵后的桑葚汁中花青素含量增加[32]。有研究表明，花青素的增加也可能與發(fā)酵動(dòng)力學(xué)有關(guān)，Versari等[33]研究了發(fā)酵過(guò)程中浸漬時(shí)間對(duì)花青素濃度的影響，位于葡萄皮中的花青素隨浸漬時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸被提取，且花青素含量隨時(shí)間增加而增加，直至穩(wěn)定期后迅速下降。由此可見(jiàn)，選擇合適的發(fā)酵工藝能夠有效提高藍(lán)莓汁花青素含量。

3 結(jié)論

乳酸菌SH-470適合制備發(fā)酵型藍(lán)莓汁，接種量、發(fā)酵溫度與時(shí)間均影響藍(lán)莓汁抗氧化酶活力與活菌數(shù)。響應(yīng)面結(jié)果表明回歸模型具有顯著性，發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量以及接種量和發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間和溫度、乳酸菌接種量和蔗糖添加量的交互作用對(duì)抗氧化酶活力有顯著影響。乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓汁的最優(yōu)條件：發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量0.1%、蔗糖添加量6%，該條件下SOD酶活力為 261.63 U/mL，總酚含量為413.40 mg/L，總花青素含量為206.40 mg/L，活菌數(shù)為2.18×1011CFU/mL。與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后藍(lán)莓汁抗氧化活性顯著增強(qiáng)，DPPH清除率達(dá)到了99.40%。

經(jīng)分析，藍(lán)莓汁中單體花青素組分為13 種，含量相對(duì)較高的花青素單體成分為錦葵色素-3-O-半乳糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-半乳糖苷。乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓汁過(guò)程中，單體花青素組分種類未發(fā)生變化，含量變化顯著。其中，錦葵色素-3-O-半乳糖苷含量顯著增加，發(fā)酵24 h時(shí)為59.59 μg/mL，與發(fā)酵前相比增加16.87%。研究結(jié)果可為藍(lán)莓資源綜合利用提供理論依據(jù)。本研究探討了發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓汁活性物質(zhì)和抗氧化活性的影響，然而產(chǎn)品的外觀和口感也直接影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的選擇，因此后續(xù)研究可對(duì)發(fā)酵藍(lán)莓汁口感等感官指標(biāo)進(jìn)一步調(diào)配和改善。