白腐真菌降解麥麩纖維關(guān)鍵基因挖掘

宋 鑫，蘇 浩，蔣詩雨，李 力*

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.四子王旗市場監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 011800

來源廣泛且具有抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等功能活性的麥麩膳食纖維屬于木質(zhì)纖維素，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，復(fù)雜的物化構(gòu)造限制了其作為生態(tài)學(xué)重要資源的發(fā)展和使用[1]。白腐菌中蘊(yùn)含完整的細(xì)胞外木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)，是目前最高效的木質(zhì)及膳食纖維素降解微生物之一[2]。實(shí)驗(yàn)室前期通過篩選得到1株對小麥麩皮具有高改性效率的白腐菌菌株A.polytricha5.584，通過優(yōu)化后對小麥麩皮木質(zhì)素的降解率達(dá)到68.72%[3-4]，需要在分子層面上對其降解麥麩纖維的機(jī)制進(jìn)行深入研究。

轉(zhuǎn)錄組是某個(gè)群體或細(xì)菌在某一生長發(fā)育階段或各種特殊功能境況下轉(zhuǎn)錄得到的全部RNA的集合體，可以從總體高度深入研究基因組結(jié)構(gòu)各種功用和基因組構(gòu)造，闡明單個(gè)生物過程和生物過程中的基因分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測序法(RNA-seq)是研究生物功能基因組的重要方式，同時(shí)也是基因功能與構(gòu)造研究的重要基礎(chǔ)與出發(fā)點(diǎn)[5]。劉家豪[6]對紅側(cè)耳菌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了與玉米秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解有關(guān)的基因89個(gè)，其中70個(gè)為上調(diào)基因，證明了溶解性多糖單氧酶在玉米秸稈木質(zhì)纖維素的分解中起著重要作用。

目前，使用野生型白腐真菌對麥麩纖維進(jìn)行生物改性已經(jīng)取得了較好的效果，但其降解麥麩木質(zhì)纖維素的分子機(jī)理并不明晰，且白腐真菌以麥麩纖維作為單一碳源時(shí)，其胞外纖維素酶系的表達(dá)調(diào)控機(jī)制也鮮有報(bào)道，因此難以使用分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行定向突變和選育[7]。作者通過RNA-seq對白腐菌A.polytricha5.584在不同碳源下的差異表達(dá)基因開展功能注釋、GO與KEGG功能分類和蛋白網(wǎng)絡(luò)互作的分析，篩選出與麥麩纖維降解相關(guān)的基因，為在分子水平上揭示白腐真菌降解麥麩纖維的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

麥麩：河南中鶴有限公司；菌株A.Polytricha5.584：中國國家普通微生物學(xué)菌種保存管理中心福建省三明真菌研究院，試驗(yàn)前將菌株儲(chǔ)存于PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基上或25 ℃的培養(yǎng)基盒中。

Trizol、RNase-free：賽默飛世爾科技公司；異戊醇、乙醇(75%)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

PDA培養(yǎng)基(g/100 mL)：PDA 3.7，KH2PO40.25，MgSO40.15，VB10.05，土霉素 0.02。

麥麩纖維液態(tài)培養(yǎng)基(g/100 mL)：麥麩纖維5.0，K2HPO40.1，F(xiàn)eSO40.005，KH2PO40.1，MgSO40.02，CaCl2·2H2O 0.01，(NH4)2SO40.2，MnSO40.002。

葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)基(g/100 mL)：葡萄糖2.0，F(xiàn)eSO40.005，K2HPO40.1，KH2PO40.1，MgSO40.02，CaCl2·2H2O 0.01，(NH4)2SO40.2，MnSO40.002。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS智能恒溫恒濕箱：寧波市東南儀表公司；JP-1500B高速萬能粉碎機(jī)：永康市久品工貿(mào)公司；JM-F50膠體磨：浙江省麥特隆機(jī)器有限公司；數(shù)顯恒溫式水浴鍋：金壇市佳美儀表公司；DHG-9011A電熱恒溫干燥盒：上海市精宏實(shí)驗(yàn)儀器機(jī)械設(shè)備公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 麥麩膳食纖維的制備

麥麩磨碎后過40目篩，將麥麩和蒸餾水按質(zhì)量比1∶ 10配制，用膠體磨處理25 min；干燥后調(diào)節(jié)加水量(1∶ 10)，95 ℃蒸30 min；降溫至50 ℃以下，加入HCl調(diào)pH值為5.6，升溫至95 ℃；加入淀粉酶(1.5%)，攪動(dòng)30 min；降溫至50 ℃以下，加入NaOH調(diào)pH值至9.0，攪拌均勻；加入堿性蛋白酶(3%)，攪動(dòng)2 h，升溫至100 ℃滅酶；酶解的麥麩用自來水洗滌數(shù)遍，直到洗滌液不渾濁；置于烘箱中，60 ℃直至烘干。

1.3.2 菌絲培養(yǎng)及取樣

將保藏菌株注射在PDA平板培養(yǎng)基(9 cm)上，25 ℃培養(yǎng)14 d使菌絲完全長滿平板，取中央菌絲，分別注射至裝有100 mL麥麩纖維液態(tài)培養(yǎng)基、葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，封口后置于27 ℃、180 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)7 d后依次取培養(yǎng)液6 mL，室溫條件下4 000 r/min離心10 min，去除上清液，菌體用無菌水充分重懸3次，洗滌步驟重復(fù)5次以上，直至完全去除培養(yǎng)基雜質(zhì)，菌體洗滌液干凈透明。得到不少于200 mg的活菌體，轉(zhuǎn)入冷凍存管封口，儲(chǔ)存于液體氮?dú)夤拗小?/p>

1.3.3 RNA 提取與轉(zhuǎn)錄組測序

用液氮把菌株細(xì)胞研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至2 mL試管中。加1.5 mL的Trizol，充分搖勻后，室溫靜置5 min，10 000 r/min離心5 min。向細(xì)胞上清液中加入200 μL異戊醇(上清液與異戊醇體積比24∶ 1)和1 mL裂解試劑，10 000 r/min離心10 min，把細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)至等體積異丙醇的試管中，于-20 ℃的冰箱中冷卻1 h。13 600 r/min離心20 min后，用1 mL 75%乙醇結(jié)晶上清液，并靜置3～5 min。RNA用30～100 μL RNase-free水溶解。采集后的RNA通過NanoDrop系統(tǒng)檢測濃度，RNA的結(jié)構(gòu)完整性通過Agilent2100生物分析儀測試，檢驗(yàn)無誤后，開展菌株的轉(zhuǎn)錄組測序。

用mRNA富集法對總RNA進(jìn)行加工。用含有OligodT的磁珠富集含有polyA尾巴的mRNA，然后再用打斷buffer將獲得的RNA片段化，用隨機(jī)的N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將人工合成的cDNA二鏈形成雙鏈DNA。將制備的雙鏈DNA末端補(bǔ)平并5′末端磷酸化，3′端成為凸起1個(gè)“A”的粘末端，再接上一條3′端有凸起“T”的鼓泡形連接器。把鏈接物質(zhì)經(jīng)過特異的引物實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。然后將PCR物質(zhì)經(jīng)過熱改性為單鏈結(jié)構(gòu)，再用一種橋型引物使單鏈結(jié)構(gòu)DNA環(huán)化，獲得單鏈結(jié)構(gòu)環(huán)狀DNA文庫并上機(jī)檢測。

轉(zhuǎn)錄組測序委托深圳市華大基因技術(shù)服務(wù)公司，利用高通量測序平臺(tái)BGI-500，開展paired-end測序。為使后續(xù)的組裝和分析結(jié)果更為可信，使用華大自主開發(fā)的過濾軟件SOAPnuke(版本：v1.4.0；參數(shù)：-l 5 -q 0.5 -n 0.1)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并使用trimmomatic(版本：v0.36；參數(shù)：ILLUMINACLIP:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:50)進(jìn)行過濾，過濾后的Clean reads用于后續(xù)的研究和分析。

1.3.4 基因信息的基礎(chǔ)分析

數(shù)據(jù)過濾方式：采用SOAPNuke進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，trimmomatic進(jìn)行過濾，過程包括：除去含有連接的reads(連接污染)；除去未知堿基N濃度超過5%的reads；除去較低品質(zhì)的reads(質(zhì)量值小于10的堿基占該reads總堿基數(shù)的比率超過20%的reads)。

參照基因組的比對方式：首先采用Bowtie2 (版本：v2.2.5;參數(shù)：-q-p hred64-sensitive-dp ad 0-gbar 99999999-mp 1，1-np 1-score-min L，0，-0.1-p 16-k 200)[8]將clean reads比對到參考基因組順序，然后再采用RSEM(版本：v1.2.8)[9]估計(jì)基因組和轉(zhuǎn)錄本的發(fā)表水平。

基因信息De novo組裝：首先使用Trinity(版本：v2.0.6；參數(shù)：-min_contig_length 150-CPU 8-min_kmer_co v 3-min_glue 3-bfly_opts′-V 5-edge-thr=0.1-stderr′)對clean reads(去除PCR重復(fù)以提高組裝效率)進(jìn)行De novo裝配，之后再通過Tgicl將已組裝的標(biāo)本進(jìn)行聚類分析除去數(shù)據(jù)的冗余，從而得到Unigene[10-11]。Trinity包括3個(gè)獨(dú)立模塊：Inchworm、Chrysalis、Butterfly，分別處理了大量reads。Trinity將reads建立為大量獨(dú)立的de Bruijn圖，然后對每個(gè)圖分別提取全長的轉(zhuǎn)錄本水平剪切亞型。De novo的組裝品質(zhì)評價(jià)：基于組裝結(jié)果，通過BUSCO數(shù)據(jù)庫對Trinity組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行品質(zhì)評價(jià)，通過與保守基因進(jìn)行比較，進(jìn)而說明轉(zhuǎn)錄組的組裝效果[12]。

編碼序列CDS(Coding sequence)的預(yù)測：使用Trinity推薦的軟件Transdecoder(版本：v3.0.1)識別Unigene中的候選編碼區(qū)，并首先獲得最長的開放閱讀框，之后再使用Blast比對Swiss-Prot和Hmmscan搜索Pfam蛋白同源順序，進(jìn)而預(yù)測編碼區(qū)。具體步驟：(1)使用 TransDecoder.LongOrfs通過對Unigene.fa進(jìn)行開放的讀碼框查找，以獲得更長讀碼框順序；(2)通過序列相似性用Diamond Blastp把Unigene.fa結(jié)果比對在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)上，然后再使用Hmmscan對Blast結(jié)果在pfam數(shù)據(jù)庫檢索；(3)利用TransDecoder.Predict估計(jì)Unigene.fa的編碼順序。

微衛(wèi)星序列標(biāo)記方法：使用MISA(版本：v1.0;參數(shù)：1-12，2-6，3-5，4-5，5-4，6-4 100 150)對Unigene進(jìn)行檢測，使用Primer3 (版本：v2.2.2)對檢測到的SSR 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[13-14]。

1.3.5 基因表達(dá)量與表達(dá)量分布的分析

通過Bowtie2 (修訂版：v2.2.5；參數(shù)：-q-p hred64-sensitive-dpad 0-gbar 99999999-mp 1，1-np 1-score-min L，0，-0.1-p 16-k 200)將clean reads比對到基因組順序上，并且利用RSEM(修訂版：v1.2.8)測算各個(gè)樣本中的基因組表達(dá)水平。根據(jù)各個(gè)樣本的表達(dá)量FPKM信息，繪制密度圖。

1.3.6 差異基因的篩選與功能注釋

DEGseq(參數(shù)：差異倍數(shù)2倍以上且Q-value≤0.001)方法基于泊松分布，根據(jù)Wang等[15]描述的方式，進(jìn)行了差異基因測定。RNA測序也可被視為隨機(jī)取樣的步驟，每次read在樣本中都獨(dú)立而均勻地采樣。在這種假設(shè)下，來自整個(gè)基因組(轉(zhuǎn)錄本)的read數(shù)目遵循二項(xiàng)分布(并且近似由泊松分布代替)。通過上述的數(shù)據(jù)模型，DEGseq給出了一種基于MA-plot的新方式，MA-plot是應(yīng)用于芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析工具，讓C1和C2顯示由2個(gè)樣品中得到的特定基因的read總量，按照Ci～binomial(ni，pi)，i=1，2分布，其中ni代表所有比對上的read總量，pi代表該基因的概率。DEGseq定義M=log2C1-log2C2和A=(log2C1+log2C2)/2，并證明在隨機(jī)抽樣假設(shè)下，給定A=a (a是A的觀察值)的條件下分布，M遵循近似正態(tài)分布。對MA圖上的每個(gè)基因都進(jìn)行假設(shè)并檢驗(yàn)H0： p1=p2與H1： p1p2。然后根據(jù)正態(tài)分布計(jì)算P, 參考Scheid等[16]的方法把P-values修正為Q-values。為增加DEGs的準(zhǔn)確率，界定了差異倍數(shù)為2倍以上且Q-value≤0.001的基因，并遴選為顯著差異表達(dá)基因。

使用hmmscan(版本：v3.0)、Blast(版本：v2.2.23)和Blast2GO(版本：v2.5.0)對Trinity組裝得到的Unigene與七大功能數(shù)據(jù)庫(NR(Non-Redundant Protein Sequence Database)、NT(Non-Redundant Protein Sequence Database)、Swiss-Prot、KOG(Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes)、GO(Gene Ontology)、KEGG(Encyclopedia of Genes and Genomes)、Pfam(Protein Families Database))進(jìn)行比對注釋。當(dāng)基因功能注釋結(jié)果不同時(shí)，為保證生物學(xué)意義，按照NR、Swiss-Prot和KOG的順序?qū)⒈葘Y(jié)果作為此基因的注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與質(zhì)量控制評估結(jié)果

采用BGISEQ-500平臺(tái)一共測了38.18 Gb數(shù)據(jù)，重組和去冗余后共得出31 531個(gè)Unigene，總長度、平均總長度、n50及GC濃度依次為57 226 025、1 814、2 537 bp和52.42%。通過把Unigene比對到七大功能數(shù)據(jù)庫并加以注解，結(jié)果依次有26 646 (NR：84.51%)、5 590(NT：17.73%)、16 359(Swiss-Prot:51.88%)、15 404(KOG:48.85%)、18 475(KEGG:58.59%)、8 638(GO:27.40%)以及20 686(Pfam:65.61%)個(gè)Unigene獲得功能注釋。利用Transdecoder檢查出24 404個(gè)CDS，同樣還檢查出1 989個(gè)SSR散布于1 536個(gè)Unigene中。

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及與參考基因組的比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。各樣品堿基質(zhì)量值Q30均不小于86.65%。各樣品的Clean Reads與參考基因組的比對效率為 86.29%～89.49%，數(shù)據(jù)利用率較高，表明所選參考基因組能夠滿足后續(xù)分析的需求。

表1 測序數(shù)據(jù)及比對參考基因組結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Results statistics of sequencing data and reference genome

2.2 麥麩纖維處理組與葡萄糖對照組差異表達(dá)基因與表達(dá)量分布分析

使用DEGseq軟件進(jìn)行麥麩纖維組與葡萄糖組之間的差異性基因表達(dá)分析，以差異倍數(shù)≥2且Q-value≤0.001的基因體作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，得出了2組樣品中間的不同表達(dá)基因體集，DEGs(differentially expressed genes)共12 096條，當(dāng)中上調(diào)基因8 214條，下調(diào)基因3 882條。使用hmmscan、Blast和Blast2GO軟件對所有DEGs在各個(gè)數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中執(zhí)行功能注釋的結(jié)果如表2所示，可知在各個(gè)數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中被注釋的DEGs總量有所不同，最后共計(jì)31 531個(gè)DEGs獲得注解，共計(jì)2 073個(gè)DEGs被所有數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)同時(shí)注釋。

表2 注釋的差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of annotated differentially expressed genes

對于各種注釋的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，選取了KEGG、GO、NR、NT、Swiss-Prot基因注釋數(shù)據(jù)庫作出5維的差異表達(dá)基因的Venn圖(圖1)，由各樣本FPKM密度分布可以看出麥麩纖維液態(tài)培養(yǎng)下與葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)下RNA的表達(dá)量密度曲線分布不同，但組間表達(dá)密度分布曲線相互接近，表明分組合理且組間存在差異，樣本表達(dá)量密度如圖2所示。

圖1 KEGG、GO、NR、NT、Swiss-Prot差異表達(dá)基因注釋維恩圖Fig.1 Venn diagram of differentially expressedgenes by KEGG, GO, NR, NT, and Swiss-Prot

圖2 樣本表達(dá)量密度圖Fig.2 Density map of sample expression

GO是一種國際標(biāo)準(zhǔn)化的生物基因活性分類系統(tǒng)，用來描述生命體中基因及其所翻譯蛋白質(zhì)的多種屬性[17]，并把基因表達(dá)形成的不同功能歸納為與生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能有密切聯(lián)系的類型。本研究對處理組和對照組通過GO注釋進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，認(rèn)為所獲得的基因轉(zhuǎn)錄組共計(jì)8 638個(gè)基因得到GO注釋，其中有3 415個(gè)與得到注釋的基因是不同基因，并且它們都被標(biāo)記在了三大主要功能分類目的42個(gè)二級條目中(20+12+10)。在3 415個(gè)不同基因中，注釋在“生物過程”功能的二級功能“細(xì)胞新陳代謝步驟(GO:0008152)”中的不同基因表達(dá)數(shù)共有1 088個(gè)；注釋在“細(xì)胞組分”功能的二級功能“膜(GO:0016020)”中的差異基因數(shù)量有1 111個(gè)；注釋在“基因分子結(jié)構(gòu)和功能”功能的二級功能“催化活性(GO:0003824)”中的差異基因數(shù)量最多，有1 818個(gè)。

對全部的3 415個(gè)功能差異基因進(jìn)行GO注釋富集解析，篩選出了在三大主要功能分類中校正P<0.01的二級條目共26條，包括“生物過程”類別中的10個(gè)類目；“細(xì)菌組成”類別中的5個(gè)類目；“分子物質(zhì)構(gòu)成和功用”類別中的11個(gè)類目。綜合GO數(shù)據(jù)庫中提出的主要類目功能描述，可將這些類目分為兩組：一組是直接參與細(xì)胞能量新陳代謝流程，是白腐菌在麥麩纖維等基質(zhì)環(huán)境生長過程中所必需的能量代謝過程；另一組則是參與木質(zhì)纖維素等麥麩纖維基質(zhì)氧化分解與代謝過程，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、蛋白酶的氧化與還原活性等4個(gè)基因本體功能類目，如表3所示。

表3 GO富集麥麩纖維降解相關(guān)類目統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of GO enriched wheat bran fiber degradation related categories

KEGG是理解高等各種特殊功能和生物學(xué)體系(如細(xì)菌、生物學(xué)和人類)，從分子水平數(shù)據(jù)資料信息，尤其是大規(guī)模分子水平數(shù)據(jù)信息集形成的基因測序和一些高通量科學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的實(shí)用程序數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)資源[18]，是全球最常見的生物信息數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)之一。

經(jīng)過比對，在KEGG信息庫中共有4 310條Unigene信息進(jìn)行了標(biāo)注，涉及5條主通道：細(xì)胞進(jìn)程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、新陳代謝(metabolism)、有機(jī)合成信息系統(tǒng)(organismal systems)；21條子通路[19]。如圖3所示，參與新陳代謝總體通路 (global and overview maps)的基因有2 132個(gè)；參與新陳代謝下的碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和細(xì)胞進(jìn)程下的運(yùn)送和分解代謝物(transport and catabolism)通路的基因分別有1 087和701個(gè)；最少的是參與新陳代謝下的外源性生物蛋白與新陳代謝物(xenobiotics biodegradation and metabolism)通路的基因，僅有12個(gè)。

圖3 KEGG通路分類圖Fig.3 KEGG pathway classification map

2.3 蛋白功能網(wǎng)絡(luò)互作圖

為了尋找與麥麩纖維降解過程相關(guān)的重要基因，通過分析降解麥麩纖維的白腐菌中不同表達(dá)基因，獲得相關(guān)的調(diào)控交互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用在線網(wǎng)站STRING[20]分析不同表達(dá)基因的蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)和Hub基因。使用DIAMOND[21]將所有基因比對至STRING數(shù)據(jù)庫，并使用與所有已知蛋白的同源關(guān)系獲得所有基因之間的互作關(guān)聯(lián)[22]?；蜷g的互作關(guān)系有評分(150～1 000)，得分越高則互作關(guān)系越可靠，默認(rèn)篩選出評分≥300的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系作圖。

在GO數(shù)據(jù)庫中，將生物調(diào)節(jié)、碳利用、新陳代謝流程、負(fù)控制生物學(xué)流程、正控制生物學(xué)流程、控制生物學(xué)流程、抗氧化活性、結(jié)合、催化活性條目下FC(Fold Change)前500的差異基因進(jìn)行蛋白功能網(wǎng)絡(luò)互作分析，獲得了一個(gè)含有不同基因的66條互作關(guān)聯(lián)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將互作數(shù)據(jù)中的Hub基因確認(rèn)并展示出來，如圖4所示。結(jié)果顯示Hub基因分別為10條互作關(guān)系的CL16.Contig1_All和10條互作關(guān)系的CL1024.Contig1_All。

圖4 GO分類下的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein interaction network diagram with GO classification

如圖5所示，在KEGG條目下，可以從碳水化合物新陳代謝、能源新陳代謝、糖類生物學(xué)組成和新陳代謝、輔助因子和維生素代謝通路下FOC值前500的差異基因進(jìn)行蛋白功能網(wǎng)絡(luò)互作，獲得了一個(gè)含有113條互作關(guān)聯(lián)不同基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并將互作數(shù)據(jù)中的Hub基因確認(rèn)并展示出來。結(jié)果顯示，Hub基因分別為10條互作關(guān)系的CL16.Contig1_All、CL710.Contig10_All、CL3860.Contig3_All和15條互作關(guān)系的CL2915.Contig1_All。它們之間存在較強(qiáng)的相互作用關(guān)系，可能是白腐真菌降解麥麩纖維的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步探索麥麩纖維降解的菌種培養(yǎng)、菌種優(yōu)化和效率提升提供基礎(chǔ)。

圖5 KEGG分類下的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Protein interaction network diagramwith KEGG classification

3 結(jié)論

通過對麥麩纖維或葡萄糖為單一碳源培養(yǎng)的白腐菌A.polytricha5.584的基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序，獲得了12 096個(gè)差異表達(dá)基因，GO富集結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要參與了白腐菌在麥麩纖維等基質(zhì)環(huán)境生長過程中所必需的能量代謝過程，以及麥麩纖維基質(zhì)的酶促氧化分解與代謝過程。經(jīng)GO和KEGG功能注釋與富集解析后通過蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，得到5個(gè)與A.polytricha5.584降解麥麩木質(zhì)素機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵基因。其中有1個(gè)注釋到GO數(shù)據(jù)庫中“氧化還原酶活性”的過氧體水合酶脫氫酶基因(CL16.Contig1_All)表達(dá)調(diào)高，有2個(gè)注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫中“醛脫氫酶家族”的醛脫氫酶基因(CL1024.Contig1_All、CL2915.Contig1_All)，1個(gè)注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫中“短鏈脫氫酶”的短鏈脫氫酶基因(CL710.Contig10_All)，1個(gè)注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中“碳代謝”的三羥基萘還原酶基因(CL3860.Contig3_All)。這些基因與白腐菌A.polytricha5.584降解麥麩纖維過程高度相關(guān)。其中注釋到GO數(shù)據(jù)庫中“氧化還原酶活性”的過氧體水合酶脫氫酶基因(CL16.Contig1_All)同時(shí)出現(xiàn)在了經(jīng)篩選GO條目和經(jīng)篩選KEGG條目后得到的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖中，且其在兩個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖中的熱度之和最高，值得進(jìn)一步研究關(guān)注。