小兒支氣管哮喘發(fā)作期中醫(yī)證型與PI3K/AktmiR-126通路的相關(guān)性分析*

王文亮 李 紅 徐甘霖 趙靈平

（廣東省深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518026）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是兒科常見病。據(jù)報道顯示，我國0～14歲兒童哮喘發(fā)生率為0.11%～0.23%［1］。哮喘在中醫(yī)屬“哮病”范疇，其在急性發(fā)作期如得不到有效控制，可演變?yōu)槁韵?，?yán)重影響兒童身心健康［2］。準(zhǔn)確辨證是中醫(yī)取得療效的前提條件之一。哮喘在發(fā)作期辨寒熱，緩解期辨肺、脾、腎之虛弱，因此哮喘證候分為：寒哮、熱哮、肺脾氣虛、肺腎兩虛［3］。對于哮喘的辨證論治，中醫(yī)學(xué)多從整體系統(tǒng)層面入手，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多從客觀指標(biāo)檢測入手，將兩者的優(yōu)勢進(jìn)行結(jié)合，將有助于臨床的診治［4］。據(jù)研究顯示，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路與支氣管哮喘進(jìn)展息息相關(guān)［5］。此外，微小 RNA-126（miR-126）能通過促進(jìn)PI3K/Akt信號通路參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［6］。但未見小兒支氣管哮喘發(fā)作期中醫(yī)證型與PI3K/Akt-miR-126通路相關(guān)性的報道?；诖?，本研究探討小兒支氣管哮喘發(fā)作期中醫(yī)證型與PI3K/AktmiR-126通路激活程度的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1）西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：反復(fù)發(fā)作喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽，夜間和晨間多發(fā)，常與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激以及上呼吸道感染、運(yùn)動等有關(guān)；發(fā)作時雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長，上述癥狀和體征可經(jīng)治療緩解或自行緩解；支氣管舒張試驗陽性（吸入支氣管舒張劑后，F(xiàn)EV1增加＞12%，且FEV1絕對值增加≥200 mL）；支氣管激發(fā)試驗陽性；呼吸流量峰值平均每日晝夜變異率＞10%，或呼吸流量峰值周變異率＞20%。符合上述癥狀和體征，同時具備氣流受限客觀檢查中的任一條，并除外其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽，可以診斷為哮喘。2）辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：（1）寒哮型。主癥：喘息、咳嗽、氣短、喉中哮鳴有聲，胸膈滿悶、咯痰稀白有泡沫或呈黏沫狀。次癥：惡寒發(fā)熱、頭疼身痛、口不渴、渴喜熱飲；舌脈：舌質(zhì)淡、苔白滑、脈浮緊或弦緊；滿足2個及以上主癥、舌脈，并有2個及以上次癥即可診斷。（2）熱哮型。主癥：喉中哮鳴如吼、氣粗息涌。次癥：咳嗽、痰黃黏稠、胸膈煩悶、面紅汗出、口渴，或伴發(fā)熱；舌脈：舌質(zhì)紅、苔黃膩、脈滑數(shù)。滿足上述主癥，并且同時滿足至少3項次癥，結(jié)合舌脈即可診斷為熱哮型。3）納入標(biāo)準(zhǔn)：符合哮喘急性發(fā)作期西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；符合《中醫(yī)兒科學(xué)》辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，將哮喘組患兒分為寒哮型、熱哮型；年齡＜14周歲。4）排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；并發(fā)其他嚴(yán)重疾患者；不配合研究者。

1.2 臨床資料

選取2020年1月至2021年12月深圳市兒童醫(yī)院收治的76例哮喘急性發(fā)作期兒童作為哮喘組。入組患兒按中醫(yī)證型分為寒哮型組40例，熱哮型組36例。選入同期30例體檢健康兒童作為對照組。所有兒童的監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書，且本研究經(jīng)本院倫理委員會審批通過。3組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；且寒哮型組和熱哮型組病程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組臨床資料比較

1.3 儀器與試劑

1）主要儀器：HDL-5臺式低速離心機(jī)（上海安亭，中國）、超凈工作臺（蘇州凈化，中國）、Mx3000P實時熒光定量PCR儀（Stratagene，美國）、Infinite酶標(biāo)儀（TECAN，瑞士）。2）主要試劑耗材：八聯(lián)管（Axygen，美國）、無RNA酶吸頭（Axygen，美國）、96孔板（Axygen，美國）、IL-6 ELISA kit（聯(lián)科生物，杭州）、IL-1 ELISA kit（聯(lián)科生物，杭州）、基因引物合成（Invitrogen，美國）：miR-126-Upstream：5'-GGGGTCGTACCGTGAGT-3'；miR-126-Downstream：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6-Upstream：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；U6-Downstream：5'-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3'；PI3K-Upstream：5'-CGTGGGAGTACGTGAAACCT-3'；PI3K-Downstream：5'-CTGCTTTTGGGAGAGTCTGG-3'；Akt1-Upstream：5'-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3'；Akt1-Downstream：5'-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3'；β-actin-Upstream：5'-ATACCACCGCCAGGATGTTTAC-3'；β-actin-Downstream：5'-CCAACAGTTGGTCACAGAGGTC-3'。

1.4 研究方法

1.4.1 外周血樣本采集 按完全統(tǒng)一的方法收集研究對象外周血樣2次。其中1份用標(biāo)準(zhǔn)抗凝管取2 mL左右，并馬上分離外周血單核細(xì)胞，然后存放-80℃冰箱待用。另1份用標(biāo)準(zhǔn)生化管取5 mL左右，并馬上分離血清，然后存放-80℃冰箱待用。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測 采用TRIzol提取外周血單核細(xì)胞總RNA，檢測合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-126以U6為內(nèi)參基因；PI3K、Akt1均以β-actin為內(nèi)參基因。上機(jī)檢測后，按2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

1.4.3 ELISA檢測 采用促凝血管提取外周血，離心（2 000 r/min，10 min，4℃）后小心提取上層血清，按照白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）專用ELI-SA試劑盒說明書相關(guān)步驟進(jìn)行操作。

1.4.4 哮喘控制評估 用哮喘控制測試（ACT）量表測評兒童哮喘病情［8］。該表共7個問題，患兒獨立完成前4個問題，每個問題分值范圍0～3分，監(jiān)護(hù)人完成后3個問題，每個問題分值范圍0～5分。量表總分25分，得分越高的患兒，提示病情控制得越好。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS23.0和Prism7.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用“%”描述，組間比較用χ2檢驗，多組間比較用R×C卡方檢驗。計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）描述，比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用方差分析F檢驗（兩兩比較用LSD-t檢驗）。用Pearson分析雙變量之間的相關(guān)性；進(jìn)一步用多元線性回歸分析不同中醫(yī)證型患兒miR-126與ACT評分的關(guān)系，以不同中醫(yī)證型患兒miR-126為自變量，以ACT評分為因變量，并排除傳統(tǒng)因素（性別、年齡、病程）的影響。用二分類Logistic回歸分析PI3K/Akt-miR-126通路的激活與不同中醫(yī)證型患兒發(fā)病的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組miR-126、PI3K、Akt1、炎癥因子水平及ACT評分比較

見表2。各組miR-126、PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達(dá)從高至低依次為寒哮型＞熱哮型＞對照組（均P＜0.01）；且寒哮型的ACT評分低于熱哮型（P＜0.01）。

表2 各組miR-126、PI3K、Akt1、炎癥因子水平及ACT評分比較（±s）

表2 各組miR-126、PI3K、Akt1、炎癥因子水平及ACT評分比較（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.01；與熱哮型組比較，▲P＜0.01。下同。

組別熱哮型組寒哮型組對照組ACT（分）23.19±1.45 15.95±0.60-n 36 40 30 miR-126 2.06±0.86△3.50±1.26△▲1.00±0.00 PI3K 2.33±0.96△4.60±1.52△▲1.00±0.00 Akt1 3.22±0.99△5.10±1.65△▲1.00±0.00 IL-6（ng/mL）5.94±2.07△9.85±2.07△▲3.95±0.42 IL-1（ng/mL）12.06±1.17△16.65±2.03△▲8.66±0.63

2.2 不同中醫(yī)證型患兒miR-126與PI3K、Akt1、炎癥因子水平的相關(guān)性

見表3。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，不同中醫(yī)證型（熱哮型、寒哮型）哮喘患兒miR-126與PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達(dá)均呈正相關(guān)（均P＜0.01）。

表3 不同中醫(yī)證型miR-126與PI3K、Akt1、炎癥因子水平的相關(guān)性

2.3 不同中醫(yī)證型患兒miR-126與ACT評分的關(guān)系

見表4。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，熱哮型組miR-126與ACT評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.790，P＜0.01）；寒哮型組miR-126與ACT評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.871，P＜0.01）。排除傳統(tǒng)因素（性別、年齡、病程）的影響，多元線性回歸分析進(jìn)一步顯示熱哮型或寒哮型組miR-126表達(dá)與ACT評分仍呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.01）。

表4 多元線性回歸分析結(jié)果

2.4 PI3K/AKT-miR-126通路的激活與不同中醫(yī)證型患兒發(fā)病的相關(guān)性

見表5。因變量賦值：健康兒童＝0、熱哮型發(fā)病=1，以中位數(shù)為界值將miR-126、PI3K、Akt1轉(zhuǎn)換為二分類變量進(jìn)行賦值：miR-126≤2.01=0、miR-126＞2.01=1，PI3K ≤ 2.08=0、PI3K＞2.08=1，Akt1≤ 3.00=0、Akt1＞3.00=1；健康兒童=0、寒哮型發(fā)病=1，以中位數(shù)為界值將miR-126、PI3K、Akt1轉(zhuǎn)換為二分類變量進(jìn)行賦值：miR-126≤3.22=0、miR-126＞3.22=1，PI3K ≤5.01=0、PI3K＞5.01=1，Akt1≤5.27=0、Akt1＞5.27=1。結(jié)果顯示，外周血單核細(xì)胞中miR-126＞2.01、PI3K＞2.08、Akt1＞3.00為熱哮型組發(fā)病的危險因素（均P＜0.01）；miR-126＞3.22、PI3K＞5.01、Akt1＞5.27為寒哮型組發(fā)病的危險因素（均P＜0.01）。

表5 二分類Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”“咳嗽”“哮喘”等范疇，是一類易出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作、痰鳴如吼、氣息喘促和呼吸困難的疾患。目前，中醫(yī)家對兒童哮喘急性發(fā)作期辨證論治分型仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［9］，其中寒哮證和熱哮證是大家一致認(rèn)可的證型。有學(xué)者提出，中醫(yī)現(xiàn)代化是中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化、客觀化［10］，由此探索應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物來協(xié)助辨證論治是符合中醫(yī)基礎(chǔ)理論思想的。

本研究結(jié)果顯示，miR-126、PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達(dá)從高至低依次為寒哮型＞熱哮型＞對照組；且寒哮型的ACT評分低于熱哮型。寒哮證是哮喘重要的證型之一，該證型多因寒邪侵襲入肺，臟腑功能失調(diào)，津液輸布不利，肺氣宣降不利，發(fā)為喘息［11］。《金匱要略》中“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”，即是針對寒哮型哮喘急性發(fā)作期患者治療的重要理論［12］。此外，熱哮證是哮喘另一重要證型，該證型多因內(nèi)有伏痰，遇感引觸，伏痰久瘀亦可化熱，則發(fā)為熱哮［13］。哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與氣道炎癥反應(yīng)、氣道重塑、免疫失衡和變態(tài)反應(yīng)等有關(guān)。IL-6是一類常見促炎因子，可與IL-1協(xié)同促T細(xì)胞增殖，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而參與自身免疫反應(yīng)。據(jù)研究表明，哮喘兒童炎癥反應(yīng)得以減輕后，將有助于緩解呼吸道高反應(yīng)性，進(jìn)而改善氣道阻塞和支氣管痙攣癥狀［14］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，AKT是PI3K的直接下游效應(yīng)體，PI3K/Akt通路在氣道平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)沉積中發(fā)揮推進(jìn)作用，進(jìn)而參與哮喘的進(jìn)展［15-16］。據(jù)研究證實，高山素可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/NF-κB信號軸抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制支氣管哮喘的作用［17］。血清miR-126水平被證實與兒童哮喘嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)［18］。以上這些研究結(jié)論與本研究基本一致。

在血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在miR-126調(diào)控PI3K/ATK信號軸，從而影響血管新生、細(xì)胞遷移等功能。于是，本研究進(jìn)一步分析了不同中醫(yī)證型患兒miR-126與PI3K、Akt1、炎癥因子的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證型（熱哮型、寒哮型）哮喘患兒miR-126與PI3K、Akt1、IL-6、IL-1表達(dá)均呈正相關(guān)，提示在哮喘患兒中可能同樣存在miR-126與PI3K/Akt信號軸相關(guān)調(diào)控作用，共同促進(jìn)炎癥反應(yīng)的過程。兒童肺、脾、腎三臟功能不足可致脾胃虛寒，寒哮型哮喘本為寒邪入侵所致，由此可能是寒哮證患兒外周血單核細(xì)胞中miR-126表達(dá)高于熱哮型的原因?？梢娡ㄟ^對PI3K/Akt-miR-126通路中關(guān)鍵因子檢測，能作為小兒哮喘發(fā)作期中醫(yī)分型的輔助手段。本研究在排除傳統(tǒng)因素（性別、年齡、病程）的影響，多元線性回歸分析結(jié)果顯示熱哮型或寒哮型miR-126與ACT評分呈負(fù)相關(guān)，提示不同中醫(yī)證型小兒哮喘發(fā)作期外周血單核細(xì)胞miR-126表達(dá)越高，表明病情控制得越差。在小鼠哮喘模型中已發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-4和IL-5等促炎因子，能通過參與氣道重塑，介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎性浸潤［19］。據(jù)臨床前試驗研究提示，阻斷PI3K/Akt信號軸可以通過多種機(jī)制控制小鼠氣道重塑［20］。然而，目前鮮見PI3K/Akt-miR-126通路與哮喘患兒發(fā)病的相關(guān)性報道。本研究結(jié)果顯示，外周血單核細(xì)胞中miR-126＞2.01、PI3K＞2.08、Akt1＞3.00為熱哮型組發(fā)病的危險因素；miR-126＞3.22、PI3K＞5.01、Akt1＞5.27為寒哮型組發(fā)病的危險因素；提示PI3K/Akt-miR-126通路的過度激活參與了不同中醫(yī)證型兒童哮喘發(fā)作期的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證型小兒哮喘發(fā)作期均與外周血單核細(xì)胞PI3K/Akt-miR-126通路的過度激活相關(guān)。PI3K/Akt-miR-126通路的關(guān)鍵因子表達(dá)在不同中醫(yī)證型哮喘患兒中存在顯著差異，可能具有作為哮喘患兒發(fā)作期中醫(yī)分型的客觀參考指標(biāo)。然而，本研究仍存在一定的局限性，如樣本量偏少、缺乏不同中醫(yī)證型小兒哮喘緩解期和持續(xù)期的研究數(shù)據(jù)，還需進(jìn)一步開展多中心、大樣本和更多證型的研究，以期為兒童哮喘的辨證論治提供更可靠的客觀研究數(shù)據(jù)。