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    參竹心康湯抗心衰大鼠心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究*

    2022-11-23 03:25:22成笑楠喻正科趙文博李玉瑩
    中國(guó)中醫(yī)急癥 2022年11期
    關(guān)鍵詞:卡托普利纖維化心肌

    成笑楠 喻正科 趙文博 李玉瑩

    (1.湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校,湖南 株洲 412012;2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410006)

    參竹心康湯是湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院喻正科教授的經(jīng)驗(yàn)方,具有益氣養(yǎng)陰,活血化瘀之功效,治療心力衰竭療效確切[1]。嚴(yán)重心力衰竭患者1年生存率小于50%[2]。前期研究表明[3-5],參竹心康湯能改善HF大鼠心肌重構(gòu),具有明顯抗心肌纖維化作用,該方抗心肌纖維化作用與調(diào)控TGFβ1/CTGF通路有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察參竹心康湯對(duì)微小核糖核酸-21(miRNA-21)/磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)以及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)的影響,探討參竹心康湯改善心力衰竭心肌纖維化的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康SD雄性大鼠55只,SPF清潔級(jí),體質(zhì)量(200±30)g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理號(hào)為2020-0052。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

    參竹心康湯(組成:黨參、麥冬、黃芪、三七、澤蘭、五味子、玉竹、丹參、黃精、葶藶子、姜黃),藥材購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科,煎藥機(jī)煎藥,濃縮至含生藥4.5 g/mL,冷卻后置于4℃冰箱備用??ㄍ衅绽ㄈA中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H42020384,批號(hào)20190203,規(guī)格25 mg×100片),藥片研磨成粉,加入蒸餾水混勻,制成質(zhì)量濃度為3.25 mg/mL的混懸液,置于4℃冰箱備用。

    1.3 試劑與儀器

    Masson染色試劑盒(維爾生物科技有限公司,批號(hào)20201215);miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國(guó)北京康為世紀(jì),CW2141);CD31抗體,α-SMA抗體(英國(guó)Abcam,批號(hào)分別為ab28364、ab7817);CoraLite488標(biāo)記的山羊兔抗IgG(H+L),CoraLite594標(biāo)記的山羊鼠抗IgG(H+L),PTEN抗體,GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(美國(guó)Proteintech,批號(hào)分別為SA00013-2、SA00013-3、22034-1-AP、10494-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2)。光學(xué)顯微鏡(Motic,BA410T);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司,H1650R);熒光定量RCP儀,熒光PCR板(美國(guó)Thermo,型號(hào)分別為PIKOREAL96、SPL0960)。

    1.4 模型制備

    隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取45只大鼠復(fù)制CHF模型,采用腹主動(dòng)脈縮窄法[4]造模,剩余10只大鼠為假手術(shù)組。假手術(shù)組僅用無(wú)菌4號(hào)手術(shù)線(xiàn)穿過(guò)腹主動(dòng)脈下方,不結(jié)扎腹主動(dòng)脈,其余操作步驟與造模組相同。造模后8周,從兩組中隨機(jī)各抽取3只大鼠,采用二維超聲引導(dǎo)M型曲線(xiàn)測(cè)量射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)。與假手術(shù)組比,造模組LVIDd有所增加(P<0.05),LVIDs、LVESV均顯著增加(P<0.01),EF、FS值均顯著下降(P<0.01),提示CHF大鼠造模成功。見(jiàn)表1。

    表1 兩組大鼠手術(shù)8周后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較(±s)

    表1 兩組大鼠手術(shù)8周后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較(±s)

    注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

    組別假手術(shù)組造模組n 3 3 LVIDd(mm)5.73±0.83 7.03±0.45△LVIDs(mm)3.03±0.47 4.67±0.49△△EF(%)83.67±3.21 58.33±4.51△△FS(%)47.33±3.79 27.00±3.00△△LVESV(μL)73.33±30.55 253.33±72.34△△LVEDV(μL)463.33±174.74 610.00±193.13

    1.5 分組與給藥

    造模成功后大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利組和參竹心康湯組,加上假手術(shù)組,共4組。假手術(shù)組和模型組蒸餾水灌胃10 mL/kg;卡托普利組卡托普利混懸液灌胃7.8 mg/kg;參竹心康湯組參竹心康湯濃縮液灌胃44 g/kg。各組均每天給藥1次,持續(xù)6周。課題組前期實(shí)驗(yàn)[5-6]表明參竹心康湯高劑量組改善心肌纖維化效果最優(yōu),因此本實(shí)驗(yàn)參竹心康劑量設(shè)計(jì)為44 g/kg。

    1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

    給藥結(jié)束后將大鼠麻醉致死,取左心室分兩部分,一部分放于4%多聚甲醛溶液中固定,4℃保存。經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后切片,用于心肌病理學(xué)檢測(cè)。另一部分迅速冷藏存放于-80℃液氮中用于RT-PCR及Western blotting試驗(yàn)。

    1.6.1 Masson染色法觀(guān)察心肌病理變化 大鼠心肌石蠟切片常規(guī)脫蠟,按Masson試劑盒操作說(shuō)明染色、無(wú)水乙醇沖洗、吹干、透明、封片,使用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察心肌纖維化程度。

    1.6.2 RT-PCR法檢測(cè)心肌miRNA-21含量 取大鼠心肌組織0.25 mg,按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取心肌組織總RNA并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度,以組織總mRNA為模板,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄cDNA,50℃孵育50 min,85℃孵育5 min,以檢測(cè)的基因引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,取cDNA反應(yīng)液1 μL進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性10 min、95℃15 s、60℃30 s,經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值,ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,-ΔΔCt=對(duì)照組ΔCt-各樣品 ΔCt,2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因表達(dá)水平的比值。在網(wǎng)址http://www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl?terms=214中搜索miRNA序列,運(yùn)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工合成引物,引物序列見(jiàn)表2。

    表2 引物序列

    1.6.3 Western blotting檢測(cè)心肌PTEN的表達(dá) 取心肌組織0.025 g,完成蛋白提取后取5x蛋白上樣緩沖液50~200 μL蛋白上清中混勻,用沸水煮5 min后放入冰盒中冷卻備用,然后進(jìn)行電泳,制備凝膠并轉(zhuǎn)膜,配制5%的脫脂奶粉,封閉90 min,孵育一抗,PTEN(1∶2 000),GAPDH(1∶3 000),4℃孵育過(guò)夜,洗膜后孵育二抗,HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(1∶5 000),HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶6 000),25℃孵育90 min,ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光,掃描曝光后的底片,使用Quantity one專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件對(duì)底片進(jìn)行分析。

    1.6.4 免疫熒光雙染檢測(cè)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá) 將左室心肌石蠟切片脫蠟并水化,將切片浸入EDTA緩沖液(pH9.0),加熱后冷卻至室溫,用0.01 mol/L PBS(pH7.2~7.6)洗滌3次,再依次置入硼氫化鈉溶液、蘇丹黑染液中漂洗,使用10%正常血清/5%BSA封閉60 min,依次滴加孵育稀釋的一抗、二抗,DAPI工作液37℃染核,PBS沖洗3次,緩沖甘油封片后避光保存,使用熒光顯微鏡(400倍)觀(guān)察,應(yīng)用Image-Pro Plus5.1分析軟件,在相同的光學(xué)條件下測(cè)定表達(dá)CD31、α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(IOD)值。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠心肌組織病理改變

    見(jiàn)圖1。假手術(shù)組心肌細(xì)胞之間僅有極少量藍(lán)染的膠原纖維;與假手術(shù)組相比,模型組心肌組織經(jīng)染色后見(jiàn)可大量藍(lán)染的心肌膠原纖維呈網(wǎng)格狀包繞正常心肌細(xì)胞,大面積纖維化組織代替正常心肌組織;與模型組相比,卡托普利組和參竹心康湯組心肌組織中膠原纖維顯著減少,但較假手術(shù)組膠原纖維量仍有所增多。

    圖1 各組大鼠心肌組織病理改變(Masson染色,400倍)

    2.2 各組大鼠心肌miRNA-21表達(dá)水平比較

    見(jiàn)表3。結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比,模型組、卡托普利組、參竹心康湯組大鼠miRNA-21表達(dá)升高(P<0.05);與模型組比,卡托普利組、參竹心康湯組的miRNA-21表達(dá)顯著下降(P<0.01),與卡托普利組比,參竹心康湯組miRNA-21表達(dá)顯著下降(P<0.01)。

    表3 各組大鼠心肌miRNA-21及PTEN表達(dá)水平比較(±s)

    表3 各組大鼠心肌miRNA-21及PTEN表達(dá)水平比較(±s)

    注:與假手術(shù)組比較,△P<0.05,△△P<0.01,;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與卡托普利組比較,*P<0.05,**P<0.01。下同。

    組別n miRNA-21PTEN假手術(shù)組模型組卡托普利組參竹心康湯組7 7 7 7 1.20±0.22 6.74±0.70△△4.20±0.63△△#1.98±0.47△#**0.29±0.04 0.07±0.02△△0.12±0.02△△#0.18±0.03△△#**

    2.3 各組大鼠心肌PTEN蛋白表達(dá)比較

    見(jiàn)表3,圖2。與假手術(shù)組相比,模型組、卡托普利組、參竹心康湯組的PTEN蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01);與模型組相比,卡托普利組、參竹心康湯組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與卡托普利組比,參竹心康湯組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。

    圖2 各組大鼠心肌PTEN蛋白電泳圖

    2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞CD31、α-SMA表達(dá)比較

    見(jiàn)表4,圖3。綠色熒光為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,紅色熒光為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。結(jié)果顯示,假手術(shù)組中大量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性,而僅有極少量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性;模型組中則有大量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性,僅有少量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性,且模型組中CD31的表達(dá)較假手術(shù)組顯著減少(P<0.01),α-SMA的表達(dá)較假手術(shù)組顯著增加(P<0.01);參竹心康湯組與卡托普利組中大量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性,且CD31的表達(dá)較模型組顯著增加(P<0.01);僅有少量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性,且α-SMA表達(dá)較模型組減少(P<0.05)。

    表4 各組大鼠心肌組織中CD31、α-SMA的表達(dá)比較(±s)

    表4 各組大鼠心肌組織中CD31、α-SMA的表達(dá)比較(±s)

    組別假手術(shù)組模型組卡托普利組參竹心康湯組n 7 7 7 7 CD31 2 808.00±183.13 769.00±341.94△△2 366.29±296.44△△##2 050.57±265.11△△##*α-SMA 1 271.71±163.79 5 260.86±1 925.15△△1 792.57±277.72△△#1 814.71±281.58△△#

    圖3 各組大鼠心肌CD31、α-SMA表達(dá)(免疫熒光,400倍)

    3 討 論

    心肌纖維化是心衰發(fā)展過(guò)程中的重要病理變化,是由多種病理因素導(dǎo)致的心肌組織中成纖維細(xì)胞異常激活,進(jìn)而引起心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞的異常增殖,細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維過(guò)量沉積,心臟間質(zhì)重塑的一個(gè)過(guò)程[7]。EndMT是內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程,在此過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞逐漸失去其特征性標(biāo)志物,如CD31等,獲得間質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物,如α-SMA等[8]。內(nèi)皮細(xì)胞在解剖學(xué)上類(lèi)似于鱗狀上皮,有基底極性并呈緊密連接狀態(tài)。在胚胎發(fā)育期間,來(lái)自心內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加心臟瓣膜和心臟的隔膜、促進(jìn)脈管和淋巴管內(nèi)膜的形成[9]。而在病理狀態(tài)下,心肌組織中的內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞,并分泌細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)膠原蛋白,這些物質(zhì)的病理性積累可破壞正常心肌結(jié)構(gòu),造成心肌纖維化[10]。在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中,有27%~33%的成纖維細(xì)胞來(lái)源于發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞[11],這就促進(jìn)了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測(cè)中,CHF大鼠大量心肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性,僅有少量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性,表明HF大鼠心肌纖維化程度與End MT成正相關(guān)。由此可見(jiàn),End MT是心肌纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵機(jī)制。

    miRNA-21與心血管疾病的發(fā)展有著密切的關(guān)系[12]。miRNA-21在正常心肌中呈弱表達(dá),但在心衰狀態(tài)下的心肌細(xì)胞中表達(dá)豐富,可以顯著抑制成纖維細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)心肌肥大和心肌纖維化。miRNA-21在心衰患者血清中濃度也會(huì)顯著升高[13]。miRNA-21的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌纖維化的進(jìn)展[14]。本實(shí)驗(yàn)造模后,大鼠miRNA-21表達(dá)升高(P<0.05),而干預(yù)后,卡托普利組、參竹心康湯組的miRNA-21表達(dá)顯著下降(P<0.01)。PTEN 定位于染色體10q23.31上[15],PTEN具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶的雙重磷脂酶活性,可以通過(guò)脂質(zhì)磷酸酶的活性負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路[16]。磷脂酰肌3-激酶(PI3K)是一種進(jìn)化上保守的脂質(zhì)磷酸激酶,可以通過(guò)產(chǎn)生PIP3來(lái)激活絲氨酸蛋白激酶Akt,Akt活化的功能形式是p-Akt,具有促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分裂增殖等作用。本實(shí)驗(yàn)造模后,PTEN蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01),而干預(yù)后卡托普利組、參竹心康湯組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。miRNA-21可通過(guò)PTEN/Akt通路調(diào)控體內(nèi)外內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[16-17]。敲除大鼠體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞中的miRNA-21基因,心肌纖維化中α-SMA間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目及Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)顯著減少,心肌纖維化的進(jìn)程也得到延緩。miRNA-21通過(guò)PTEN通路在TGF-β1誘導(dǎo)EndMT中發(fā)揮作用[18]。

    參竹心康湯由黨參、麥冬、黃芪、丹參、三七、澤蘭等藥物組成。方中黨參健脾益氣,令心氣生成有源,麥冬滋心陰養(yǎng)心血,二者共為君藥。黃芪助黨參培土生金,葶藶子使外滲之津得瀉,丹參、三七、姜黃、澤蘭活血化瘀,瘀血得化,新血得生,心體得養(yǎng),共為臣藥。黃精上助黃芪補(bǔ)肺氣,中助黨參健脾益氣,下資腎臟益腎填精;五味子收澀外滲之津,玉竹養(yǎng)陰生津,佐助麥冬養(yǎng)心陰、生心血,同為佐藥。諸藥合用,心肺之氣充沛,陰血足而血脈充,瘀血化而血脈通,氣陰得補(bǔ),瘀血得化,具有益氣養(yǎng)陰,活血化瘀之功效。前期研究表明參竹心康湯可以通過(guò)多種神經(jīng)、體液途徑改善心衰心肌纖維化。其中主要成分從不同途徑實(shí)現(xiàn)抗心肌纖維化功能,如黃芪中的黃芪多糖通過(guò)抑制TGF-β1/Smads通路從而達(dá)到抑制心肌纖維化的作用[19];麥冬可通過(guò)抑制TGF-β1、p-Smad2/3和Smad2/3蛋白表達(dá)改善大鼠心肌纖維化[20];丹參素通過(guò)抗心肌纖維化改善急性心肌梗死,與抑制TGF-β/CTGF通路相關(guān)[21];三七皂苷通過(guò)降低心房顫動(dòng)大鼠血清和心房組織ICAM-1、TNF-α、MMP-2水平,升高TIMP-2水平抑制心肌纖維化[22]。本實(shí)驗(yàn)研究提示,CHF大鼠心肌發(fā)生了明顯的纖維化改變。CHF大鼠心肌組織中miRNA-21的表達(dá)上升(P<0.05),PTEN表達(dá)下降(P<0.01),表明纖維化的心肌組織中miRNA-21基因負(fù)性調(diào)控了PTEN的表達(dá)。經(jīng)參竹心康湯干預(yù)后,miRNA-21表達(dá)下降(P<0.01),PTEN的表達(dá)上升(P<0.01),大量細(xì)胞表達(dá)CD31陽(yáng)性,且CD31的表達(dá)較模型組顯著增加(P<0.01),僅有少量細(xì)胞表達(dá)α-SMA陽(yáng)性,且α-SMA表達(dá)較模型組減少(P<0.05),提示End MT逆轉(zhuǎn)。

    總之,參竹心康湯可能通過(guò)抑制miRNA-21的表達(dá)調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路,從而抑制End MT,減輕心肌纖維化,治療心力衰竭。

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