補(bǔ)腎法中藥調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用研究*

劉 爽 徐家淳 孫偉明 曹藝萌 王以申

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

隨著社會(huì)人口老齡化急劇發(fā)展，阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)［1-2］。AD是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。因此，AD患者極易發(fā)生跌倒等意外事故，繼而引發(fā)髖部骨折等一系列并發(fā)癥。同時(shí)，有認(rèn)知缺陷的AD患者患腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加［3-4］。既往報(bào)告中指出大約2/3的AD患者為女性［5］。表明AD發(fā)病與中老年女性雌激素水平變化密切相關(guān)［6］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素E2水平降低后會(huì)導(dǎo)致胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK/MAPK）信號(hào)通路中各關(guān)鍵因子活化水平下降，進(jìn)而激活一系列下游效應(yīng)因子加重AD的病理變化［7］。基于此，本研究以ERK/MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)p-ERK1/2為切入點(diǎn)，探討補(bǔ)腎法中藥治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)3月齡雌性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。所有大鼠在SPF級(jí)隔離飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)，給予充足的飼料和飲水，22℃，光照為12 h光照/黑暗循環(huán)。

1.2 藥物及試劑

1）補(bǔ)腎法中藥制備：組成為淫羊藿10 g，補(bǔ)骨脂5 g，制首烏5 g，女貞子10 g（購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房）。將上述藥物150 g（共5劑）混勻，加1 000 mL蒸餾水浸泡12 h，再加水1 000 mL，以80℃超聲30 min，過濾、提取，反復(fù)3次，混合濾液，以100℃水浴加熱，濃縮至500 mL，最終生藥質(zhì)量濃度為0.3 g/mL。藥液常溫冷卻后，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?）Aβ25-35的制備：無菌生理鹽水將Aβ25-35（Sigma公司）稀釋成4 μg/μL，37℃孵育96 h變?yōu)榫奂癄顟B(tài)備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置（北京碩林苑科技有限公司），SDS-PAGE電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio Image system Gene公司），大鼠腦立體定位儀（BENCHmark公司）。

1.4 造模及分組

將36只雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組12只、模型組12只、中藥組12只。模型組和中藥組采用單側(cè)側(cè)腦室注射Aβ25-35方法制作AD大鼠模型。10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，將鼠頭固定，備皮，碘伏消毒，頭頂部正中切口，暴露前囟，按大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行側(cè)腦室定位：前囟點(diǎn)后方1.5 cm，旁開1.0 cm，深度為4.0 cm。緩慢注射5 mL聚集態(tài)的Aβ25-35溶液，注射持續(xù)5 min，留針5 min，使Aβ充分彌散，緩慢出針耗時(shí)5 min。骨科蠟封堵，雙氧水消毒，常規(guī)縫皮；假手術(shù)組向側(cè)腦室注入生理鹽水5 mL，操作與模型組一致。術(shù)后各組大鼠腹腔注射青霉素4萬U/只，連續(xù)3 d預(yù)防感染。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模后1周，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估AD模型是否建立成功。

1.5 干預(yù)方法

參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［8］中“人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值表”進(jìn)行給藥劑量計(jì)算。中藥組于造模成功后予以中藥灌胃，按劑量10 mL/kg，每日1次，持續(xù)12周。假手術(shù)組及模型組于給藥組相同時(shí)間點(diǎn)，給予中藥相等劑量的蒸餾水灌胃，每日1次，持續(xù)12周。

1.6 觀察項(xiàng)目

1.6.1 大鼠認(rèn)知記憶能力檢測(cè) 利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)AD模型大鼠認(rèn)知記憶力能力進(jìn)行檢測(cè)。將水池分為4個(gè)象限，每個(gè)象限入水點(diǎn)的池壁上貼上不同的場(chǎng)景標(biāo)記，平臺(tái)置于第2象限區(qū)域中央，略低于水面2 cm。實(shí)驗(yàn)前將大鼠分別放入水迷宮中自由游泳2 min適應(yīng)游泳環(huán)境。定位航行測(cè)試開始時(shí)，隨機(jī)選取4個(gè)象限入水點(diǎn)之一，將大鼠頭朝池壁放入水中，記錄大鼠入水至找到平臺(tái)時(shí)間為逃避潛伏期。若大鼠在2 min內(nèi)未找到隱匿平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引向隱匿平臺(tái)，其潛伏期記錄為120 s，每次訓(xùn)練間隔為60 s，歷時(shí)4 d，每天1次。攝像機(jī)位于水迷宮水池中央上方約200 cm，用于記錄動(dòng)物的位置、游泳的軌跡距離和時(shí)間（用于計(jì)算出游泳速度）。

1.6.2 大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況 取大鼠海馬CA1區(qū)組織切片，采用尼氏（Nissl）染色方法，切片脫臘，蒸餾水沖洗；加1%甲苯胺藍(lán)水溶液后置于54℃的溫箱內(nèi)浸染25 min，蒸餾水沖洗，95%的乙醇分化30 s；用無水乙醇脫水，二甲苯透明，加蓋玻片，再用中性樹膠封片，境下觀察。

1.6.3 Western blotting檢測(cè)p-ERK1/2蛋白的表達(dá) 取各組大鼠海馬組織進(jìn)行勻漿處理，按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒抽提總蛋白質(zhì)，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，封閉處理。加一抗（p-ERK1/2，1∶1 000），搖床上低溫孵育過夜，TBS洗膜；加二抗（1∶5 000），搖床上常溫孵育2 h后，TBS洗膜。利用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，借助熒光成像儀觀察相關(guān)蛋白的表達(dá)，應(yīng)用軟件對(duì)所得圖像結(jié)果測(cè)量灰密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠死亡情況

實(shí)驗(yàn)過程中共有3只動(dòng)物死亡，其中假手術(shù)組2只，中藥組1只。

2.2 各組大鼠認(rèn)知記憶能力比較

見表1。與假手術(shù)相比，模型組大鼠平均速度無顯著差異（P＞0.05），潛伏時(shí)間明顯延長(zhǎng)，學(xué)習(xí)能力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組大鼠平均速度無顯著差異（P＞0.05），潛伏時(shí)間明顯縮短，學(xué)習(xí)能力明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行平均速度、學(xué)習(xí)能力比較（±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行平均速度、學(xué)習(xí)能力比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

學(xué)習(xí)能力（s）組別假手術(shù)組模型組中藥組n 6 6 6平均速度（mm/s）185.02±25.78 189.01±32.55 182.20±45.63第1天29.70±1.97 40.38±4.12*37.61±6.48第2天13.58±2.23 28.30±6.17*15.73±1.70△第3天13.31±2.55 22.41±4.19*14.12±2.38△第4天10.98±1.10 18.83±2.60*10.95±0.93△

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況

見圖1。大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)量比較（尼氏染色，200倍）

2.4 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較

見表2，圖2。Western blotting結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠ERK/MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白p-ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，中藥組p-ERK1/2蛋白的表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

圖2 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較（相對(duì)灰度值，±s）

表2 各組大鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較（相對(duì)灰度值，±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組n 6 6 6 p-ERK1/β-actin 0.61±0.03 0.10±0.04*0.29±0.05△p-ERK2/β-actin 0.58±0.01 0.15±0.02*0.28±0.04△

3 討 論

隨著社會(huì)人口老齡化的發(fā)展，AD等老年退行性疾病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)［1］，因其起病隱匿而被稱為“沉默的殺手”。而AD患者發(fā)病后由于神經(jīng)功能的退變，可引發(fā)視覺障礙、記憶障礙、行為模式等發(fā)生變化，降低了AD患者生活自理能力，增加了跌倒等意外事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［9-10］，極易引發(fā)骨折、出血等一系列并發(fā)癥。因患者長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)功能受限，臥床時(shí)間長(zhǎng)，深靜脈血栓形成，增加了肺部感染的概率。由Aβ引發(fā)的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致腦血管系統(tǒng)受損，使AD患者更易伴發(fā)腦血管病變［3］，成為AD患者緊急就醫(yī)治療的主要原因，嚴(yán)重者可致殘甚至致死［11］，進(jìn)一步威脅著AD患者的身心健康，增加了家庭生活和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［12］。因此，有效防治AD發(fā)生與發(fā)展具有重要意義。

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女AD的發(fā)病率高出同年齡男性2～3倍［6］，而絕經(jīng)后婦女最顯著的變化即為雌激素［主要為雌二醇（E2）］水平的明顯降低。已有研究證明AD女性患者血清中E2水平同樣明顯降低，其記憶水平的改變與E2含量改變呈正相關(guān)［13］。而且臨床上應(yīng)用雌激素替代療法（ERT）也確有明顯降低AD發(fā)生與發(fā)展的作用，但因其副作用明顯，而限制了該療法的應(yīng)用與推廣［14］。因此，治療AD更加安全有效的方法亟待發(fā)現(xiàn)。

研究顯示，E2通過非基因組效應(yīng)激活細(xì)胞內(nèi)的ERK/MAPK信號(hào)通路，是絲裂原MAPK信號(hào)通路中重要的一員，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、分裂、死亡以及細(xì)胞間的功能同步化等起主要調(diào)節(jié)作用。激活的ERK/MAPK信號(hào)通路能進(jìn)一步激活多種下游效應(yīng)因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等，并調(diào)控基因的表達(dá)，共同作用于神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而發(fā)揮減緩AD相關(guān)病理變化及抑制細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用［7］。經(jīng)典ERK/MAPK信號(hào)通路通過三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，促使ERK磷酸化形成p-ERK，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［15］。

中醫(yī)經(jīng)典“腎藏精”臟象理論認(rèn)為，“腎生髓，腦為髓之?！??！夺t(yī)學(xué)入門》指出，“腦者髓之?！鑴t腎主之”。由此可見，腦與腎關(guān)系密切，腎精充盈，則髓海得養(yǎng)，神機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)正常。AD發(fā)病與中醫(yī)五臟中腎的關(guān)系最為密切，脾、肝兩臟亦受累，腎虛證型最為多見，腎虛精虧、髓海不足是AD形成的基本病機(jī)［16］，并始終貫穿該病的全過程，補(bǔ)腎填精、充髓健腦是防止該病的根本大法［17］?；诖耍狙芯恐嗅t(yī)辨證論治以補(bǔ)腎法立法組方，選取淫羊藿、補(bǔ)骨脂、制首烏、女貞子4味補(bǔ)腎中藥作為基礎(chǔ)方。方中制首烏補(bǔ)肝腎，益精血，烏須發(fā)，強(qiáng)筋骨；女貞子滋補(bǔ)肝腎，明目；二者合用補(bǔ)肝腎，益精髓，腎陰得養(yǎng)則五臟安。淫羊藿補(bǔ)腎壯陽，祛風(fēng)除濕，強(qiáng)筋骨；補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽，溫脾補(bǔ)腎益精；兩者合用，溫補(bǔ)脾腎，興陽壯志，腎陽強(qiáng)則五臟得之溫煦。四藥合用取之“陰中求陽，陽中求陰”之意，相輔相成，共奏補(bǔ)腎填精、充髓健腦之功。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥組大鼠潛伏時(shí)間延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，提示補(bǔ)腎復(fù)方中藥能顯著提高AD模型大鼠學(xué)習(xí)及空間記憶能力，改善其空間記憶受損情況。同時(shí)，補(bǔ)腎復(fù)方中藥可抑制AD模型大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。補(bǔ)腎法中藥干預(yù)后，可明顯增加AD模型大鼠腦組織中ERK/MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，說明補(bǔ)腎法中藥具有激活ERK/MAPK信號(hào)通路的作用。而活化的ERK/MAPK信號(hào)通路，可能通過調(diào)控下游一系列效應(yīng)因子繼而發(fā)揮減緩AD相關(guān)病理變化及細(xì)胞凋亡發(fā)生的保護(hù)作用。

綜上所述，補(bǔ)腎法中藥對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，可明顯改善AD模型大鼠認(rèn)知和記憶能力，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與調(diào)控p-ERK1/2蛋白表達(dá)，激活ERK/MAPK信號(hào)通路有關(guān)。