響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳中SPME-GC-MS檢測丁酸及應(yīng)用

宋保闊，張棟，楊玲，賈曉蒙，王世杰，

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，石家莊 050018；2.河北君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221；3.河北一然生物科技股份有限公司，石家莊 050800）

0 引言

發(fā)酵乳是乳酸菌在乳制品中發(fā)酵代謝而成的酸性乳制品[1]，不僅含有活性乳酸菌，而且乳酸菌代謝產(chǎn)物具有良好的功能特性。并且發(fā)酵乳代謝產(chǎn)生有機(jī)酸和香氣成分導(dǎo)致牛奶中重要的物理化學(xué)、感官和微生物變化[2]。液體乳制品中的游離脂肪酸作為揮發(fā)性香氣成分，及香氣成分前體，增強(qiáng)了乳制品的風(fēng)味和口感[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)丁酸是部分乳酸菌的代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是腸道微生物對(duì)機(jī)體代謝調(diào)節(jié)的重要媒介[4]，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)[5]、抑制結(jié)直腸癌和慢性炎癥[6]、增強(qiáng)腸道穩(wěn)態(tài)、預(yù)防肥胖和糖尿病等作用[7]。因此，發(fā)酵乳中的丁酸含量，可作為評(píng)價(jià)發(fā)酵乳營養(yǎng)價(jià)值的重要參考標(biāo)準(zhǔn)。

隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法以及毛細(xì)管電泳法被廣泛用于短鏈脂肪酸的檢測[8]。固相微萃取(SPME)與氣相色譜聯(lián)用是當(dāng)今常用的方法，具有靈敏度高、成本較低、操作簡便且對(duì)環(huán)境影響極小等優(yōu)勢[9]。SPME是一種基于吸附機(jī)理，將分析物的取樣、分離和富集結(jié)合到一個(gè)步驟中的樣品制備技術(shù)，常用于氣相色譜分析的樣品前處理，能夠有效地萃取食品中的揮發(fā)性物質(zhì)[10]。

采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化發(fā)酵乳制品中丁酸的萃取條件。采用四因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以丁酸濃度為響應(yīng)值，探究SPME-GC-MS定量檢測丁酸的較優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

凍存菌種：兩株植物乳桿菌LP1030、LP1071（編號(hào)Lp1、Lp2）、兩株瑞士乳桿菌LH1056、LH3（編號(hào)La1、La2）、一株德氏乳桿菌保加利亞亞種L8（編號(hào)Ld1）菌株來源河北一然生物科技股份有限公司。

1.1.2 試劑

正丁酸、戊酸 色譜純（純度>99%），阿拉丁集團(tuán)有限公司；脫脂乳粉，新西蘭恒天然集團(tuán)；氯化鈉（分析純），天津市鼎盛鑫化工有限公司；MRS Medium，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

5975C-7890A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；手動(dòng)SPEM進(jìn)樣器，50/30 umDVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Agilent公司；HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌，博納科技有限公司；BCD-270WTDGVBP/A電冰箱，海信冰箱有限公司；LRH-150F恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XFH-50CA壓力滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)，蘇州天創(chuàng)凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵乳制備

將脫脂乳粉按10%的比例溶于55℃的蒸餾水中，攪拌15 min，靜置水合30 min。分裝后以95℃、30 min條件滅菌，結(jié)束后快速冷卻至37℃。5株乳酸菌活化三代后以5%接種量接種到滅菌脫脂乳中，37℃培養(yǎng)；發(fā)酵乳培養(yǎng)時(shí)間在48、72、96 h時(shí)取樣品測量其pH和滴定酸度，若72 h與96 h的滴定酸度仍有較大差異，則繼續(xù)培養(yǎng)、測定pH和酸度，直至與上次測量結(jié)果近乎無差異為止。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)法定量檢測

準(zhǔn)確稱取4.8 g發(fā)酵乳和0.2 g合適濃度戊酸標(biāo)品與2.0 g氯化鈉混合后加入頂空瓶中，迅速蓋緊頂空瓶瓶蓋。樣品置于50℃恒溫狀態(tài)下進(jìn)行磁力攪拌，將萃取頭（250℃老化30 min）插入15 mL頂空瓶中萃取30 min，萃取完成后迅速將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，解析15 min后拔出萃取頭。準(zhǔn)確稱取4.6 g乙醇水溶液（5%）、0.2 g丁酸標(biāo)品(0.2 mg/g)、0.2 g戊酸標(biāo)品和2.0 g氯化鈉，相同操作進(jìn)行檢測。采用公式進(jìn)行定量待測乳制品中的丁酸含量。

C1為樣品的丁酸含量（mg/g）;Si1為樣品丁酸的峰面積；Si2為樣品內(nèi)標(biāo)戊酸的峰面積；Sk1為標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)物戊酸的峰面積；Sk2為標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)物丁酸的峰面積；C2為標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)物戊酸的濃度。

氣相色譜條件：萃取頭型號(hào)：50/30 umDVB/CAR/PDMS;色譜柱：DB-WAX聚乙二醇色譜柱；升溫程序：載氣為He，恒定流速為1.0 mL/min，不分流模式進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測器溫度為250℃，柱箱升溫程序見表1。

表1 柱箱升溫程序

質(zhì)譜條件：色譜-質(zhì)譜接口溫度250℃，譜庫NIST8.0.L。質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍20～200 m/z，離子源溫度230℃，電離電壓70 eV。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

加鹽量對(duì)丁酸濃度的影響。以加鹽量為自變量做單因素實(shí)驗(yàn)，萃取條件為萃取時(shí)間30 min、萃取溫度50℃、樣品質(zhì)量為4.8 g，考察加鹽量0、1.0、2.0、2.5、3.0 g對(duì)丁酸濃度和總峰面積的影響。

萃取時(shí)間對(duì)丁酸濃度的影響。以萃取時(shí)間為自變量做單因素實(shí)驗(yàn)，萃取條件為加鹽量2 g、萃取溫度50℃、樣品質(zhì)量為4.8 g，考察萃取時(shí)間25、30、35、40 min對(duì)丁酸濃度和總峰面積的影響。

萃取溫度對(duì)丁酸濃度的影響。以萃取溫度為自變量做單因素實(shí)驗(yàn)，萃取條件為萃取時(shí)間30 min、加鹽量2 g、樣品質(zhì)量為4.8 g，考察萃取溫度30、35、40、45、50、55、60℃對(duì)丁酸濃度和總峰面積的影響。

樣品質(zhì)量對(duì)丁酸濃度的影響。以樣品質(zhì)量為自變量做單因素實(shí)驗(yàn)，萃取條件為萃取時(shí)間30 min、加鹽量2 g、萃取溫度50℃，考察樣品質(zhì)量2.8、3.8、4.8、5.8 g對(duì)丁酸濃度和總峰面積的影響。

Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。在單因素的基礎(chǔ)上，以萃取溫度、萃取時(shí)間、加鹽量、樣品質(zhì)量為自變量，以丁酸濃度為響應(yīng)值，應(yīng)用Design Expert8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響規(guī)律，并得到最優(yōu)萃取條件。其因素水平編碼見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平

5種乳酸菌發(fā)酵乳中丁酸及其他揮發(fā)性物質(zhì)檢測按最佳萃取條件對(duì)5種乳酸菌發(fā)酵乳進(jìn)行揮發(fā)性成分萃取，按1.2.2的檢測方法進(jìn)行發(fā)酵乳的丁酸定量。同樣的檢測方法也可進(jìn)行對(duì)其他揮發(fā)性成分的定性檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用響應(yīng)面分析軟件Design Expert8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，采用Excel2019和SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,使用origin 2017進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖1（a）可知，加鹽量2.0 g時(shí)丁酸濃度與總峰面積均達(dá)到最高值，由此選擇2.0 g為最佳加鹽量。萃取前，添加一定量的NaCl對(duì)樣品進(jìn)行鹽析，可降低發(fā)酵乳中蛋白對(duì)揮發(fā)性香氣成分的吸附作用，從而提高萃取效果[11]。加鹽量大于2.0 g時(shí)，檢測到總峰面積下降，可能是由于加鹽量過大，阻止了揮發(fā)性成分?jǐn)U散，影響了揮發(fā)性成分分子基團(tuán)之間的作用力，從而對(duì)萃取效果產(chǎn)生負(fù)作用[12]。由圖1（b）可知，萃取時(shí)間為30 min時(shí)丁酸濃度為最高值，30 min之后總峰面積呈上升趨勢，但無顯著差異，故最佳萃取時(shí)間設(shè)定為30 min。30 min之后丁酸濃度下降。原因可能是萃取頭已達(dá)到最大萃取能力，過長時(shí)間萃取造成已附著到萃取頭上的揮發(fā)性成分?jǐn)U散，導(dǎo)致萃取效果下降[13]。升高溫度有益于揮發(fā)性物質(zhì)擴(kuò)散有利于萃取效果，但是溫度過高會(huì)降低萃取頭對(duì)萃取揮發(fā)性成分的吸附能力。由圖1（c）隨萃取溫度增加，總峰面積呈上升趨勢，但丁酸濃度呈下降趨勢，結(jié)合兩種情況，萃取最佳溫度設(shè)定為45℃。30～40℃范圍內(nèi)總峰面積上升不明顯，可能是因?yàn)闇囟冗^低導(dǎo)致發(fā)酵乳揮發(fā)性成分未充分揮發(fā)，待測物未能完全被萃取，導(dǎo)致計(jì)算出丁酸濃度結(jié)果偏大。45℃后，總峰面積上升，丁酸濃度顯著下降可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致萃取能力下降，并且可能造成部分揮發(fā)性成分變性。考慮溫度過高會(huì)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生不良影響,最佳萃取溫度選擇45℃。由圖1（d）可知，樣品質(zhì)量在4.8 g時(shí)總峰面積達(dá)到最大值，樣品質(zhì)量3.8 g和4.8 g時(shí)丁酸濃度差異并不顯著，由此選擇4.8 g為最佳樣品質(zhì)量。樣品質(zhì)量在4.8 g之后總峰面積下降?？赡苁怯捎跇悠妨吭黾樱斂掌績?nèi)空氣壓力變大，揮發(fā)性物質(zhì)逸散導(dǎo)致總峰面積下降。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

結(jié)合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取樣品質(zhì)量和加鹽量作為影響因素，以丁酸濃度作為響應(yīng)值，采用四因素三水平響應(yīng)面分析方法，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3，回歸分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)回歸分析，得到乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸的丁酸濃度模型的四元二次方程：丁酸濃度=5.46-0.65A-0.053B-0.15C+0.11D-0.48AB-0.23AC-0.086AD+0.34BC-0.14BD-0.27CD-1.24A2-1.03B2-0.47C2+0.11D2

由表4可知，F(xiàn)=3.25模型顯著（P=0.0176＜0.05）。4個(gè)因素對(duì)丁酸濃度僅有萃取溫度對(duì)丁酸濃度影響顯著。4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響作用的大小順序?yàn)锳>C>D>B，即萃取溫度＞加鹽量＞樣品質(zhì)量＞萃取時(shí)間。模型失擬性不顯著（P=0.0695＞0.05）,方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合程度較高，可以準(zhǔn)確模擬各因素對(duì)丁酸濃度的影響。

表4 回歸分析結(jié)果

由圖1（d）可知，樣品質(zhì)量的變化對(duì)總峰面積和丁酸濃度的作用均不顯著；由表4數(shù)據(jù)，AD、BD、CD和D2的P值均較高（P>0.05），樣品質(zhì)量與其他3個(gè)因素的交互作用對(duì)丁酸濃度的影響并不顯著。因此不在此列出樣品質(zhì)量與其他3個(gè)因素的交互作用響應(yīng)面圖與等值線圖。圖2是丁酸濃度對(duì)萃取溫度、萃取時(shí)間、加鹽量和樣品質(zhì)量兩兩因素交互作用的3D圖及其等高線圖。從圖2中可以看出，萃取溫度和時(shí)間對(duì)萃取后檢測丁酸濃度的影響作用較大，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較陡，這與方差分析結(jié)果一致。隨著萃取溫度的升高和萃取時(shí)間的延長，丁酸濃度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，45℃、30 min到達(dá)為最高點(diǎn)。溫度升高可以縮短樣品揮發(fā)所需要的時(shí)間，從而減少分析所用的時(shí)間。加鹽量對(duì)丁酸濃度影響較小，丁酸濃度隨加鹽量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢45℃、2.0 g為丁酸濃度最高值。隨著加鹽量的增加和萃取時(shí)間的延長，丁酸濃度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，2.0 g、30 min到達(dá)為最高點(diǎn)。

圖2 各因素相互作用響應(yīng)面與等值線

根據(jù)所得到的模型，預(yù)測最佳的萃取條件，萃取溫度為47.74℃、萃取時(shí)間為28.31 min、加鹽量為1.65 g、樣品質(zhì)量為5.8 g、預(yù)測丁酸濃度值為0.005 17 mg/g。根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整最佳萃取條件為萃取溫度48℃、萃取時(shí)間28 min、加鹽量為1.65 g、樣品質(zhì)量為5.8 g。

進(jìn)行最佳條件實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以優(yōu)化后的萃取條件對(duì)同一發(fā)酵乳進(jìn)行重復(fù)3次樣品丁酸含量測定。3次試驗(yàn)結(jié)果為0.005 0 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 165，與預(yù)測結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 12。

表5 萃取條件驗(yàn)證結(jié)果

2.3 發(fā)酵乳揮發(fā)性成分分析結(jié)果

在萃取條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵乳揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，計(jì)算出發(fā)酵乳中丁酸含量，得到總離子流圖如圖3所示，揮發(fā)性物質(zhì)及相對(duì)含量見表6。

表6 不同菌株發(fā)酵脫脂乳揮發(fā)性成分相對(duì)含量

圖3 5種發(fā)酵乳氣質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

按1.2.3中計(jì)算方法計(jì)算5種單菌株發(fā)酵脫脂乳中的丁酸含量，由高到低排序?yàn)長p1、Ld1、Lp2、La2、La1，分別為5.91、5.38、4.78、4.47、3.50 mg/kg。

對(duì)單菌株發(fā)酵脫脂乳進(jìn)行揮發(fā)性成分檢測，共檢測出30種化合物。主要化合物是有機(jī)酸類，另有少量醇類、酯類、酮類和醛類化合物。有機(jī)酸類化合物中含量最高的是乙酸，其余還檢出有丁酸、己酸等。發(fā)酵乳中的有機(jī)酸類主要是脂肪分解、乳酸代謝和蛋白質(zhì)分解3種作用產(chǎn)生的[14]。除有機(jī)酸類化合物外還有丁二酮、二庚酮、乙偶姻等酮類化合物；糠醇、2-乙基己醇等醇類化合物；苯甲醛等醛類和戊酸丁酯、丁酸丁酯等酯類化合物，都是發(fā)酵乳制品中的主要呈味物質(zhì)。此方法除了檢測丁酸等短鏈脂肪酸還可用于其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測，用于對(duì)酸奶風(fēng)味和功能的綜合評(píng)價(jià)，具體的萃取條件還需要后續(xù)試驗(yàn)綜合分析。

（續(xù)表6）

圖4 不同菌株發(fā)酵乳揮發(fā)性成分相對(duì)含量

3 結(jié)論

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用是定量檢測乳制品中揮發(fā)性成分含量的常用方法[15]，萃取條件會(huì)直接影響樣品檢測的結(jié)果。本文以單菌株發(fā)酵脫脂乳所得的發(fā)酵乳制品為樣品，以單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了對(duì)發(fā)酵乳制品中丁酸的萃取條件。

結(jié)果表明，在研究丁酸平衡頂空濃度時(shí)，萃取溫度被認(rèn)為是最關(guān)鍵的因素。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)萃取溫度對(duì)丁酸濃度和總峰面積的作用顯著，并且兩者變化趨勢相同。雖然高溫有利于分析物從基質(zhì)中釋放出來，但由于分配系數(shù)降低，會(huì)對(duì)涂層吸附分析物產(chǎn)生不利影響[13,16]。因此，當(dāng)溫度升高時(shí)，在平衡狀態(tài)下提取的揮發(fā)物量較少。所獲得的結(jié)果表明，低于30 min的萃取時(shí)間不能達(dá)到平衡狀態(tài)，而超過30 min，纖維發(fā)生飽和，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)的吸附減少。此外，30 min之后丁酸濃度下降但總峰面積上升，觀察到高揮發(fā)性化合物的萃取效率降低。正如Plutowska[17]等人之前所述，平衡時(shí)間短的化合物可以逐漸從纖維中被取代，并被揮發(fā)性較低的化合物抵消。在某些情況下，當(dāng)增加樣品體積時(shí)，在穩(wěn)定的小瓶中，SPME纖維吸附更多的揮發(fā)性化合物，然后保持相對(duì)恒定[18]。在小瓶的頂部空間中更快地達(dá)到平衡，揮發(fā)物可以更快和更有效地?cái)U(kuò)散到纖維上的涂層。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不是這樣，隨著樣品質(zhì)量的增加丁酸濃度和總峰面積均呈下降的趨勢，并且未發(fā)生顯著性變化。實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是沒有評(píng)估磁力攪拌器的速度。攪拌加速了相之間的傳質(zhì)，相平衡的建立使得揮發(fā)性較低的化合物得到更好的分離[19]。

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定了使用DVB/CAR/PDMS纖維提取的總共30種化合物，定量了單菌株發(fā)酵脫脂乳中丁酸含量。為了研究SPME變量(萃取時(shí)間、萃取溫度、樣品量和加鹽量)的影響，使用綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了萃取丁酸的最佳HS-SPME條件。驗(yàn)證優(yōu)化后的萃取條件，重復(fù)性較好，與預(yù)測值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。優(yōu)化后的方法可適用于發(fā)酵乳制品中丁酸的快速定量。