乳鐵蛋白的開發(fā)制備及在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用

肖明，李春，楊玉琢，劉春波，李春梅

（黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱 150028）

0 引言

母乳是嬰兒重要的營養(yǎng)來源，乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)作為母乳中的活性成分，在鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)、存儲及促進(jìn)紅細(xì)胞增殖等方面均發(fā)揮作用，對于嬰兒免疫力的提升和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的改善也具有重要意義[1]。當(dāng)母乳不足或其他因素導(dǎo)致嬰兒無法從母乳中攝取足夠營養(yǎng)時，嬰兒配方奶粉是母乳之外的最優(yōu)選擇，因此LF在嬰兒配方奶粉中有效合理的應(yīng)用既能滿足嬰兒生長發(fā)育的需要，又能保護(hù)嬰兒的健康，滿足了非母乳喂養(yǎng)嬰兒的營養(yǎng)需求。

LF是從牛乳中提取的天然物質(zhì)，國外產(chǎn)業(yè)化技術(shù)發(fā)展較為成熟。LF的商業(yè)化生產(chǎn)始于1985年，由比利時的Olefina公司生產(chǎn)。1989年，德國米雷有限公司和日本森永乳業(yè)株式會社成立了一家合資企業(yè)，實(shí)現(xiàn)了LF的大規(guī)模生產(chǎn)[2]。自20世紀(jì)90年代以來，數(shù)量有限(全球不到10家)的乳制品制造商定期生產(chǎn)LF。而國內(nèi)對LF產(chǎn)業(yè)化研究較少而且還沒有產(chǎn)業(yè)化，LF生產(chǎn)的核心技術(shù)被國外企業(yè)掌握且我國原料奶價格高，所以我國所需的LF都依賴進(jìn)口，荷蘭、澳大利亞等國的乳品企業(yè)因此快速占領(lǐng)了我國市場[3]。為了解決這些問題，需要對LF提取純化的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)進(jìn)行研究，開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的LF生產(chǎn)方法。本文對LF的相關(guān)特性、開發(fā)及其在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，以期推動LF的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 LF的特性

1.1 LF的分布與含量

LF是分子量在77～80 ku之間的鐵結(jié)合糖蛋白[4]。LF由哺乳動物的乳腺上皮細(xì)胞分泌，在乳汁中含量豐富。人乳的LF含量最高，約為1.0～3.0 mg/mL，牛乳的LF含量只有人乳的十分之一。在泌乳期的不同時間段，LF含量也不同，初乳中LF的含量較高，而在乳汁成熟期的中后期則較低[5]。如人初乳中LF高達(dá)7 mg/mL，早期乳為5 mg/mL，常乳期為2 mg/mL。牛初乳中的LF含量在0.8 mg/mL以上，24 h后為0.42 mg/mL，牛常乳中是0.2 mg/mL[6-7]。此外，LF廣泛存在于哺乳動物的外分泌液和組織液中，如羊水、小腸分泌液、精液、關(guān)節(jié)液、淚液等[8]。血液中也含有LF，主要由中性粒細(xì)胞分泌，子宮內(nèi)膜、唾液腺及骨髓等也能分泌少量LF[9]。

1.2 LF的組成和結(jié)構(gòu)

LF由一條多肽鏈和兩條糖鏈組成[10]，多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)約含700個氨基酸[11]，氨基酸序列因種屬來源不同而有所差別，同源性約為70%[12]。LF含有較多的賴氨酸和精氨酸，是堿性蛋白質(zhì)[13]。LF在低于其等電點(diǎn)（pI=8.9）的pH環(huán)境下帶正電，能夠結(jié)合帶負(fù)電的蛋白質(zhì)形成超分子結(jié)構(gòu)，這也是其發(fā)揮多重生物學(xué)功能的原因之一[14]。LF的二級結(jié)構(gòu)由沿著氨基酸序列交替排布的α-螺旋和β-折疊構(gòu)成[15]。LF呈圖1所示的結(jié)構(gòu)[18]，由兩個球形的羧基(C)和氨基(N)末端葉組成，兩葉通過一個三圈螺旋相連，由C1，C2，N1和N2結(jié)構(gòu)域組成，它們與兩個CO32-一起負(fù)責(zé)Fe3+的結(jié)合，且具有較高的鐵親和力（Kd=10-20M）[16]。LF可以在鐵飽和LF(Holo-lactoferrin)和脫鐵LF(Apo-lactoferrin)兩種構(gòu)象狀態(tài)之間切換，且前者比后者更穩(wěn)定[17]。

圖1 LF二級結(jié)構(gòu)示意圖[18]

在人LF中發(fā)現(xiàn)3個潛在的糖基化位點(diǎn)(Asn 138、Asn 479和Asn 624)，在牛LF中發(fā)現(xiàn)5個潛在的糖基化位點(diǎn)(Asn 233、Asn 281、Asn 368、Asn 476和Asn 545)如圖2所示[19]。LF通過N型糖基化與糖（主要是高甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖）結(jié)合。N型糖基化位點(diǎn)的數(shù)量和與LF相連的糖的類型受基因表達(dá)的精確調(diào)控，而LF對熱變性和蛋白水解的敏感性受糖基化位點(diǎn)變化的影響[8]，這些位點(diǎn)大多暴露在分子的外表面，可能參與特異性受體的識別[20]。

圖2 LF的預(yù)測結(jié)構(gòu)及其潛在的糖基化位點(diǎn)圖[19]

2 牛乳LF的制備與開發(fā)

2.1 色譜法

2.1.1 離子交換色譜

對于離子交換色譜，介質(zhì)的選擇是根據(jù)它們的陽離子交換強(qiáng)度或容量、離子特異性、機(jī)械阻力以及清潔和再生的化學(xué)穩(wěn)定性來進(jìn)行的?？傮w而言，陽離子交換層析過程可以去除牛奶或乳清中高達(dá)95%的不需要的固體[21]。劉佳欣等人[22]用陽離子交換色譜法分離牛初乳中LF，最佳分離條件為起始緩沖液pH=7.03，洗脫速度1.01 mL/min，洗脫液濃度1.01 mol/mL，上樣速度0.82 mL/min，對應(yīng)的LF的得率為84.43%。Teepakorn等[23]利用陽離子交換色譜對LF進(jìn)行了分離。LF結(jié)合在陽離子交換膜上的動態(tài)結(jié)合容量為10%，約為60 mg。在陰離子交換膜上，用pH6.0的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液，在流量為287.46 gm-2/h的條件下收集水中的LF。此外，用Sarabind S75柱子進(jìn)行了完整的分離循環(huán)，處理時間短，為34.19 min，LF生產(chǎn)率超過2628.84 mg/h。Huppertz等[24]通過離子交換層析分離LF。陽離子交換樹脂可以將LF和乳過氧化物酶一起捕獲。隨后可通過鹽梯度或pH梯度洗脫樹脂實(shí)現(xiàn)LF和乳過氧化物酶的分離，可以制備高純度(>95%)的乳鐵蛋白。離子交換色譜法操作簡單，方便快捷，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，此法的缺點(diǎn)是LF和乳過氧化物酶會被一起捕獲，所以對于此方法的研究重點(diǎn)是洗脫條件的確定。目前該方法在嬰兒配方奶粉和專業(yè)營養(yǎng)領(lǐng)域的其他產(chǎn)品中都得到了廣泛的應(yīng)用。

2.1.2 親和色譜

親和色譜是利用固定相的結(jié)合特性來吸附靶蛋白。Jayaprakash等[25]采用不含氯化鈉結(jié)合緩沖液的MEP樹脂柱進(jìn)行親和層析，乳鐵蛋白的回收率最高達(dá)91%，純度提高2.9倍。因此，MEP HyperCelTM親和層析有可能成為從牛初乳乳清中分離LF的一種潛在的替代方法。Ng等人[26]確定了適用于使用羥基磷灰石從乳清中純化LF的色譜條件并成功去除乳過氧化物酶。研究表明，80 L羥基磷灰石柱每小時可產(chǎn)生0.32 kg LF。Carvalho等人[27]的研究使用載有Cu2+（與亞氨基二乙酸(IDA)結(jié)合）的聚丙烯酰胺冷凍凝膠作為色譜過程的吸附劑來捕獲LF。超濾奶酪乳清通過cryogel-IDA-Cu系統(tǒng)并捕獲高純度的LF?？偟膩碚f，利用樹脂柱進(jìn)行的親和層析的回收率較高，純度較低，這可能是由于柱子的結(jié)合特性不夠好，后續(xù)可以加大對于柱子篩選的研究，也可以將樹脂柱親和層析與其他分離技術(shù)結(jié)合使用。利用羥基磷灰石或載有Cu2+的吸附劑進(jìn)行的親和色譜消除了由于分子量和等電特性的相似性導(dǎo)致的乳過氧化物酶共同純化的影響，該過程具有高吞吐量和低成本的優(yōu)點(diǎn)，這使得其應(yīng)用于LF的工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。

2.1.3 膨脹床色譜

膨脹床色譜技術(shù)是一種生物分離技術(shù)。Rm等人[28]為了使吸附劑在親和色譜的膨脹床中正常工作，以活性藍(lán)4作染料配體來支持吸附劑。研究首先使用三相乳液法制備了雙層瓊脂糖-鎳@活性藍(lán)4復(fù)合物，然后吸附LF納米粒子，LF納米粒的回收率約為83%。Du等人[29]使用Fastline SP作為陽離子交換劑進(jìn)行膨脹床色譜并優(yōu)化了洗脫條件。結(jié)果表明，F(xiàn)astline SP對LF的吸附速度較快，適合高速操作。在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，洗脫條件優(yōu)化為0.5 mol/L NaCl，最后成功回收乳鐵蛋白，純度為88.5%，回收率為77.1%。膨脹床色譜法的重點(diǎn)是吸附劑的選擇及洗脫條件的確定。此法可以直接從粗原料或黏性溶液中捕獲靶蛋白，具有分離效率高、處理量大、運(yùn)行成本低、可連續(xù)操作等特點(diǎn)，是可用于LF工業(yè)化分離純化的新型技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 萃取法

基于鑭系元素和Fe3+在電荷和離子半徑上具有一定的相似性，F(xiàn)an等人[30]設(shè)計了一種“除鐵-還原”固相萃取法，用于從復(fù)雜基質(zhì)中選擇性萃取LF。Tb3+在IDA改性的二氧化硅上官能化，得到Tb@SiO2微球，被用作LF萃取的高效吸附劑，SDS-PAGE結(jié)果表明獲得了高純度的LF。Pawar[31]等人利用CTAB/正庚醇組成的反膠團(tuán)體系從乳清蛋白溶液中選擇性提取LF。通過研究NaCl濃度和水相pH對LF向膠束相分配的影響，改進(jìn)了LF的選擇性萃取工藝。在水相pH為10.3、NaCl濃度為1.1 mol/L時，LF從酸性乳清到膠束相的萃取率最高(98.7%)，此時LF以94%的提取效率和100%的純度被反萃取到水相反萃取相中。Pawar等人[32]還研究了在pH=10的正庚醇中，加入1 mol/L NaCl，用50 mmol/L CTAB形成的陽離子反膠束萃取LF合成液中的LF，使蛋白質(zhì)100%被包埋在膠束相中。在添加劑(7%正丙醇或正丁醇)和電解質(zhì)(1.3 mol/L KCl)存在下以及pH為6的條件下，98%的LF被反萃取到水相中?？偟膩碚f，固相萃取要選擇獲取簡便且高效的吸附劑，如二氧化硅微球上鑭系元素的修飾簡單方便、吸附效率高，這可能有助于LF提取工藝在工業(yè)上的應(yīng)用。水相反萃取后有機(jī)相的回收表明其可以循環(huán)使用，且該方法省去了乳清的預(yù)處理步驟，因此該工藝更經(jīng)濟(jì)在工業(yè)上規(guī)?；a(chǎn)是可行的。

2.3 多種方法結(jié)合分離

2.3.1 超濾結(jié)合離子交換色譜法

Maciel等人[33]提出了一種將LF分離純化的兩種操作相結(jié)合的簡單方法。乳清蛋白經(jīng)微濾澄清，再經(jīng)超濾和透析過濾，使LF的濃縮和預(yù)純化達(dá)到1.1 mg/mL，然后用陽離子交換膨脹床色譜法對蛋白進(jìn)行純化。所得LF的純度為92.7%，回收率為87.0%。馬闖等人[34]采用超濾膜分離及離子交換色譜技術(shù)相結(jié)合的方法分離純化LF。首先乳清經(jīng)兩次膜過濾，截留50～200 ku的組分，然后通過離子交換層析進(jìn)一步純化，最終LF得率在80%以上。Rong等人[35]通過超濾從牛初乳中分離LF，然后用陽離子交換對LF溶液進(jìn)行色譜分離，所得LF的純度和回收率分別為94.20%和82.46%，再經(jīng)過脫鹽濃縮及冷凍干燥，獲得LF精制品。LF熱穩(wěn)定性很差，而超濾膜分離是一個無需加熱的物理分離過程，可以最大限度的保持LF的生物活性。此外，采用-35～-40℃的升華溫度、47 Pa的真空度作為干燥條件，能較好的保留蛋白的營養(yǎng)和保證產(chǎn)品的復(fù)水性能，利于LF的再利用[36]。超濾結(jié)合離子交換色譜法所獲得的LF的純度和回收率都較高，此方法成本適中，產(chǎn)品純度高，適合規(guī)?；a(chǎn)。

2.3.2 鹽析結(jié)合凝膠層析法

徐麗萍等[36]采用超濾、鹽析和凝膠層析相結(jié)合的方法進(jìn)行LF分離純化：使用醋酸纖維素膜對乳清進(jìn)行兩次超濾和一次濃縮，然后用50%硫酸銨除去雜蛋白，再用80%硫酸銨鹽析，最后用CM-Sephadex G-100進(jìn)行層析得到純度為92%的LF。此外，曲練達(dá)等[37]采用3次鹽析和1次凝膠層析相結(jié)合的方法從牛初乳中分離純化得到純度為92%的LF。鹽析結(jié)合凝膠層析法研究所獲得的LF純度較高，但都未提及回收率，而在LF的工業(yè)生產(chǎn)中，回收率也是一個重要指標(biāo)，為使此方法工業(yè)化，其回收率的研究是日后的工作方向。

3 LF在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用

《乳鐵蛋白人群健康效應(yīng)專家共識》指出LF可以改善嬰幼兒營養(yǎng)狀況，降低嬰幼兒腸道疾病、呼吸道疾病、缺鐵性貧血等的發(fā)病風(fēng)險[38]。目前，LF已作為一種食品添加劑用于嬰兒配方奶粉中。國外嬰兒配方奶粉中LF的添加量在0.5 mg/g左右，我國衛(wèi)生部在國家標(biāo)準(zhǔn)GB14880-2012中批準(zhǔn)LF在嬰兒配方奶粉中的添加量為≤1.0 g/kg[39]。LF具有多種生物學(xué)功能，可作為藥物和營養(yǎng)成分用于臨床[40]。LF會因其營養(yǎng)活性的不可替代性而一直受到乳制品市場的關(guān)注。

3.1 LF嬰兒配方奶粉的制備

目前，市售嬰兒配方奶粉都是理化指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)，即在宏觀量上接近母乳。但是在功能性上還與母乳存在較大的差別。向嬰兒配方奶粉中添加LF，可以促進(jìn)配方奶粉的“母乳化”。

趙紅霞[41]參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB14880-2012和國外品牌嬰兒配方奶粉中LF的添加量，并考慮母乳化程度及成本等幾方面設(shè)計配方，設(shè)定嬰兒配方奶粉中LF的添加量為50 mg/100 g。生產(chǎn)時將基粉半成品和依據(jù)配方稱重的LF、DHA、ARA等在預(yù)混機(jī)中預(yù)混，然后在干混機(jī)中干混，即得到添加LF的嬰兒配方奶粉。產(chǎn)品檢測指標(biāo)符合GB 10765-2010的要求，證明添加LF對嬰兒配方奶粉的品質(zhì)無不良影響，且產(chǎn)品在功能特性上進(jìn)一步接近母乳。

也有研究指出了新的思路，美國和一些歐洲國家市場上售有液體即食嬰兒配方乳。配方乳經(jīng)超高溫滅菌處理確保安全，但LF等營養(yǎng)物質(zhì)大量流失。因此，Wazed[42]等人為了比較不同滅菌方式對配方乳中LF保留率的影響，將100 mg LF添加到100 mL復(fù)溶的嬰兒配方粉中，然后采用巴氏滅菌和超高溫滅菌處理嬰兒配方乳。研究表明在溫度為70.8℃、時間為42 s；溫度為71℃、時間為57 s時，LF保留率分別為94.6%和91.9%，而超高溫滅菌處理的LF保留率僅為66%～83%。此外，經(jīng)巴氏滅菌后，LF明顯保持了鐵的結(jié)合能力和貯存穩(wěn)定性，這證實(shí)了巴氏滅菌技術(shù)在LF嬰兒配方乳中的應(yīng)用前景。相比于進(jìn)過噴霧干燥的配方奶粉，液體即食嬰兒配方乳的營養(yǎng)保留更多，隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高和人們認(rèn)識的提升，未來配方乳替代配方粉會成為可能。

3.2 LF嬰兒配方奶粉對嬰兒健康的影響

為明確LF對嬰兒健康的影響，國內(nèi)外多名學(xué)者針對新生兒發(fā)病率較高的敗血癥、腸炎、缺鐵性貧血、呼吸道感染等疾病通過對嬰兒喂食LF強(qiáng)化嬰兒配方奶粉或口服和腸內(nèi)補(bǔ)充LF進(jìn)行了相關(guān)研究。

新生兒敗血癥是因細(xì)菌通過血液循環(huán)進(jìn)入新生兒全身并產(chǎn)生毒素，致使新生兒多血管功能及心肌損傷并可能危及患兒生命[43]。Cornette等[44]對472名低出生體重兒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)出生體質(zhì)量＜1 500 g的新生兒口服LF治療組遲發(fā)性敗血癥發(fā)生率為5.9%，顯著低于未口服組的17.3%；對出生體質(zhì)量＜1 000 g的新生兒效果更顯著，口服LF治療組遲發(fā)性敗血癥發(fā)生率為0%，顯著低于未口服組的4.8%?？梢奓F在新生兒敗血癥中具有預(yù)防作用。Cochrane做了6個隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)，以明確腸內(nèi)補(bǔ)充LF對預(yù)防遲發(fā)性新生兒敗血癥的效果。結(jié)果表明當(dāng)腸內(nèi)補(bǔ)充LF時，即使不添加益生菌早產(chǎn)兒遲發(fā)性敗血癥也顯著減少[45]。Ochoa等[46]的研究也表明，母乳中的LF可有效預(yù)防新生兒遲發(fā)性敗血癥。

LF可以通過調(diào)節(jié)腸道的通透性和營養(yǎng)狀態(tài)加速腸上皮細(xì)胞的成熟[47]。Wulff等[48]對早產(chǎn)或低體重兒壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生率與其食用LF嬰兒配方奶粉的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示給予LF 200 mg/d的干預(yù)組未發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎，而給予生理鹽水2 mL的對照組發(fā)生5例壞死性小腸結(jié)腸炎。還有研究給嬰兒喂食LF嬰兒配方奶粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明嬰兒腸道菌群得到調(diào)節(jié)，糞便中溶菌酶活性、雙歧桿菌和有機(jī)酸含量均呈現(xiàn)增加趨勢[49]。

嬰兒吸收LF的同時，其胃腸道會吸收大量的鐵，促進(jìn)了母乳中鐵元素的吸收，所以母乳喂養(yǎng)的嬰兒很少缺鐵[50]。由此推測LF嬰兒配方奶粉也可達(dá)到促進(jìn)鐵吸收的目的。柴靈鶯等[51]的研究表明，喂食LF嬰兒配方奶粉的嬰兒缺鐵性貧血和鐵缺乏檢出率明顯下降且其外周血紅蛋白和血清鐵蛋白水平明顯升高。這個結(jié)果與Paesano等[52]的研究結(jié)果相近。此外，陳冠儀等[53]的研究也表明，給新生兒喂食強(qiáng)化LF配方奶粉可提高紅細(xì)胞的壓積比、平均體積等指標(biāo)。

King等[54]開展的攝入不同含量LF的嬰兒配方奶粉對下呼吸道感染發(fā)作頻率影響的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攝入含850 mg/L LF的實(shí)驗(yàn)組下呼吸道感染的發(fā)作頻率顯著低于攝入含102 mg/L LF的對照組。Chen等[55]的實(shí)驗(yàn)也顯示，嬰兒食用LF強(qiáng)化配方奶粉后呼吸道相關(guān)疾病發(fā)生率顯著低于對照組。還有研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒食用添加牛乳脂肪球膜和LF的嬰兒配方奶粉后，神經(jīng)元發(fā)育加快、語言得到改善，且腹瀉和與呼吸相關(guān)的疾病明顯減少[56]。

以上研究結(jié)果表明，LF可以預(yù)防嬰兒敗血癥、腸炎、缺鐵性貧血和呼吸道感染的發(fā)生，對嬰兒的健康有促進(jìn)作用。但上述研究對于健康影響機(jī)制的研究比較少，以后可以加大這方面的研究力度。此外，后續(xù)的研究還可以圍繞LF在嬰兒配方奶粉中的最適添加量來進(jìn)行。添加牛乳脂肪球膜和LF的嬰兒配方奶粉對于嬰兒健康狀況的改善也為以后的研究提供了新的方向，可以將與LF具有協(xié)同作用的活性物質(zhì)一起加入到嬰兒配方奶粉中，使其成分進(jìn)一步接近母乳，更好的滿足嬰兒的營養(yǎng)需要。

4 展望

通過將基粉半成品和LF預(yù)混、干混，可得到LF嬰兒配方奶粉，且LF嬰兒配方奶粉能夠降低嬰兒腸道疾病、呼吸道疾病、新生兒敗血癥、缺鐵性貧血等疾病的發(fā)病風(fēng)險；雖然色譜法、萃取法、超濾結(jié)合離子交換色譜法、鹽析結(jié)合凝膠層析法等為LF的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能，但是大規(guī)模、低成本、高回收率的分離純化技術(shù)仍是制約LF應(yīng)用的瓶頸。未來應(yīng)該在以下方面對牛乳LF開展進(jìn)一步研究：多種技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)更高效率，低成本的工業(yè)生產(chǎn)方法以獲取LF；對LF嬰兒配方奶粉進(jìn)行更多的安全性和耐受性評價，提供LF的確切添加量；對與LF具有協(xié)同作用的活性物質(zhì)和LF在嬰兒配方奶粉中的共同添加進(jìn)行研究。未來我國從牛乳中分離純化LF技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化勢在必行，添加LF的嬰兒配方奶粉的研發(fā)將對改善國產(chǎn)嬰兒配方奶粉的功能起到重要作用，LF嬰兒配方奶粉投放市場必將具有深遠(yuǎn)的意義。