超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定土壤中8種農(nóng)藥殘留

張大為

(實(shí)樸檢測技術(shù)(上海)股份有限公司，上海 201108)

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用，可以有效地防治病、蟲、草害，保護(hù)作物，增加糧食產(chǎn)量[1-2]，但多數(shù)農(nóng)藥都具有一定的毒性，近年來農(nóng)藥的大量使用已經(jīng)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，各環(huán)境中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，尤其是在食品中的農(nóng)藥殘留通過食物鏈直接進(jìn)入人體富集，引起中毒、致畸、致癌等疾病，給人類健康造成極大的危害[3-4]。因此農(nóng)藥殘留問題一直是人們研究的熱點(diǎn)問題，我國已制定了一系列相關(guān)法規(guī)來限制農(nóng)藥殘留問題[5]。近10年，有關(guān)飲用水和食品中農(nóng)藥殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)比較多，可檢測的農(nóng)藥的種類高達(dá)數(shù)百種，如《飲用水中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 23214—2008)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中331種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 23200.121—2021)、《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 20769—2008)等。

農(nóng)藥殘留的前處理技術(shù)有QuEChERS、固相萃取(SPE)、凝膠滲透色譜(GPC)、加速溶劑萃取法(ASE)等[6-9]。其中QuEChERS法是通過吸附劑與基質(zhì)中雜質(zhì)的相互作用來除去雜質(zhì)，具有簡單快速、省時(shí)經(jīng)濟(jì)、適用范圍廣的特點(diǎn)，在農(nóng)藥多殘留檢測中應(yīng)用廣泛[10-12]。固相萃取法是利用吸附劑與分析物的吸附作用，將分析物固定在吸附劑上，再用洗脫液洗脫，將分析物與干擾物分離，具有高效、減少雜質(zhì)引入、高回收率的特點(diǎn)，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理[13-15]。文獻(xiàn)報(bào)道中多種農(nóng)藥同時(shí)檢測的方法主要有氣相色譜法(GC)[16-17]、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)[18-19]、液相色譜法(LC)[20-21]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)[22-25]等。其中GC法和GC-MS法不適用于受熱易分解和部分不發(fā)揮性農(nóng)藥化合物的檢測；LC法可用于強(qiáng)極性、低揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥的分析，分離能力強(qiáng)，但對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)受干擾較大，檢出限相對(duì)LC-MS較高[26]；LC-MS技術(shù)同時(shí)具有色譜的強(qiáng)分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性，可減少干擾物的影響，能夠準(zhǔn)確定性定量。

土壤作為重要的農(nóng)藥殘留遷移媒介，越來越受到我國政府的重視。2017—2019年，生態(tài)環(huán)境部出臺(tái)了一系列有關(guān)土壤和沉積物中農(nóng)藥殘留檢測的重要標(biāo)準(zhǔn)，如《土壤和沉積物 有機(jī)氯農(nóng)藥的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》(HJ 835—2017)、《土壤和沉積物有機(jī)氯農(nóng)藥的測定 氣相色譜法》(HJ 921—2017)、《土壤和沉積物 氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測定 柱后衍生-高效液相色譜法》(HJ 960—2018)、《土壤和沉積物 氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測定 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法》(HJ 961—2018)、《土壤和沉積物 苯氧羧酸類農(nóng)藥的測定 高效液相色譜法》(HJ 1022—2019)、《土壤和沉積物 有機(jī)磷類和擬除蟲菊酯類等47種農(nóng)藥的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》(HJ 1023—2019)、《土壤和沉積物 11種三嗪類農(nóng)藥的測定 高效液相色譜法》(HJ 1052—2019)等，這些標(biāo)準(zhǔn)大多采用GC法、LC法和GC-MS法，僅有標(biāo)準(zhǔn)HJ 961—2018采用LC-MS法。隨著科技發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，近年來環(huán)境中農(nóng)藥殘留量會(huì)逐年降低，對(duì)其檢測方法的靈敏度要求越來越高。開發(fā)高靈敏度LC-MS法來檢測土壤中農(nóng)藥殘留，對(duì)土壤中多種農(nóng)藥殘留的監(jiān)測具有重要意義。該研究采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)建立了同時(shí)測定土壤中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、樂果、甲基嘧啶磷、三環(huán)唑、萎銹靈和唑螨酯8種農(nóng)藥殘留的分析檢測方法，以期為土壤環(huán)境中多種農(nóng)藥殘留的實(shí)時(shí)監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、樂果、甲基嘧啶磷、三環(huán)唑、萎銹靈和唑螨酯)，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司，濃度均為100 μg/mL。甲醇和乙腈均為色譜級(jí)(美國Thermofisher公司)；甲酸為LCMSMS級(jí)(國藥試劑公司)；超純水(美國Millipore公司)；C18吸附劑和PSA吸附劑(N-丙基乙二胺，40～63 μm，6 nm)，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司；PEP固相萃取柱(填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，500 mg/6 mL)和C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)，均購自天津博納艾杰爾公司；其他未注明的試劑均為國藥分析純。

1.2 儀器設(shè)備Xevo TQ-S micro超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；超聲波清洗器、漩渦混合器、離心機(jī)、氮吹儀等其他實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別準(zhǔn)確吸取8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋成1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存，準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)配制成濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理準(zhǔn)確稱取2.0 g土壤試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入適量硅藻土研磨均勻使樣品均質(zhì)，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈溶液、3～5 g NaCl，渦旋混勻2 min，于超聲清洗儀中超聲30 min，以8 000 r/min離心5 min，取上層清液過0.45 μm微孔濾膜后備用。

PEP固相萃取柱凈化法：依次加入6 mL 甲醇、6 mL 超純水充分活化固相萃取柱。取5 mL提取液用超純水稀釋至100 mL過固相萃取柱，流速控制在約3 mL/min，用超純水淋洗小柱，將固相萃取柱在負(fù)壓條件下抽真空5 min進(jìn)行干燥后，加入5 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液浸泡5 min后進(jìn)行洗脫，流速控制在約3 mL/min，收集洗脫液于離心管中，在氮吹儀上用高純氮?dú)獯抵两?，控制氮?dú)饬魇谷軇┍砻嬗屑?xì)微波動(dòng)，1 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜后，供LC-MS/MS分析。

PSA/C18吸附劑凈化法：取5 mL萃取液于預(yù)先加入150 mg無水MgSO4、150 mg PSA、150 mg C18吸附劑的離心管中，渦旋2 min，以8 000 r/min離心5 min，取上層清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，供LC-MS/MS分析。

1.5 液相色譜條件色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫。流速0.4 mL/min。柱溫40 ℃。

1.6 質(zhì)譜條件電噴霧離子化源，正離子模式ESI；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣流量為1 000 L/h；錐孔氣流量為50 L/h。碰撞氣為氬氣；脫溶劑氣為N2。檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，多反應(yīng)監(jiān)測條件見表1。

表1 8種農(nóng)藥成分的質(zhì)譜分析條件

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化該試驗(yàn)分別采用乙腈、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%甲酸-水溶液、0.1%甲酸-乙酸乙酯溶液4種提取溶劑對(duì)土壤中8種農(nóng)藥成分加標(biāo)樣(加標(biāo)濃度為1 μg/kg)進(jìn)行提取，比較其提取效率。結(jié)果表明(圖1)，用乙腈提取的共提物較多，雜質(zhì)干擾較大，目標(biāo)化合物的響應(yīng)值較差?？紤]到8種農(nóng)藥中部分成分具有一定極性，在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，在中性和酸性介質(zhì)中穩(wěn)定，且加入甲酸有助于提高目標(biāo)化合物離子化效率，提高靈敏度，因此在提取劑中加入適量甲酸進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-乙酸乙酯溶液對(duì)土壤中目標(biāo)化合物的提取效率均較差，0.1%甲酸-乙腈溶液的提取效率較高。因此最終選擇0.1%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的提取效率

2.2 凈化條件優(yōu)化該試驗(yàn)分別采用C18固相萃取柱、PEP固相萃取柱、150 mg PSA/150 mg C18吸附劑共3種凈化方式對(duì)土壤中8種農(nóng)藥成分加標(biāo)樣(加標(biāo)濃度為1 μg/kg)進(jìn)行凈化處理，比較回收率。結(jié)果表明，C18固相萃取柱凈化法的回收率較差，PEP固相萃取柱和PSA/C18吸附劑凈化法的回收率較高，達(dá)到86%～112%。其中PSA/C18吸附劑凈化法操作簡單高效，C18可清除樣品基質(zhì)中脂肪和酯類等非極性雜質(zhì)，PSA可清除許多極性雜質(zhì)，如脂肪酸、有機(jī)酸、部分色素等，對(duì)各種性能差異較大的農(nóng)藥殘留物具有較高的回收率，因此該試驗(yàn)采用150 mg PSA/150 mg C18吸附劑對(duì)樣品進(jìn)行凈化。如果樣品基質(zhì)復(fù)雜可采用PEP固相萃取柱凈化法。

2.3 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化該試驗(yàn)分別采用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L甲酸銨水共3種流動(dòng)相組合對(duì)土壤中8種農(nóng)藥成分進(jìn)行測定。結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的響應(yīng)值較低，其中氧化樂果、甲胺磷、乙酰甲胺磷3種強(qiáng)極性化合物的色譜峰具有嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，且基線噪音較大。當(dāng)采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，有助于促進(jìn)目標(biāo)化合物離子化，提高響應(yīng)強(qiáng)度，改善峰型。采用乙腈-5 mmol 甲酸銨水作為流動(dòng)相時(shí)，部分化合物在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定。因此最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

該方法以乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相，采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱進(jìn)行梯度優(yōu)化。鑒于強(qiáng)極性目標(biāo)物的出峰時(shí)間較早，影響檢測，用起始流動(dòng)相平衡1 min，延遲強(qiáng)極性目標(biāo)物的出峰時(shí)間，進(jìn)而調(diào)整流動(dòng)相的比例及其變化速率，使8種農(nóng)藥成分的色譜峰彼此分離。該方法可在10 min內(nèi)完成土壤中8種農(nóng)藥成分的分離檢測，峰型尖銳，分離效果良好。

采用濃度為1 mg/L的8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。分別在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子掃描，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下目標(biāo)化合物母離子響應(yīng)較高，且容易獲取H+，進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使每種目標(biāo)化合物的母離子和子離子的峰響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最高，并找出響應(yīng)強(qiáng)度高且穩(wěn)定存在的2個(gè)特征碎片離子作為定量離子和定性離子。優(yōu)化后8種農(nóng)藥成分多反應(yīng)檢測MRM圖譜如圖2所示。

注：a.甲基嘧啶磷(6.13 min);b.唑螨酯(6.30 min);c.樂果(4.24 min)；d.萎銹靈(4.42 min);e.甲胺磷(1.13 min)；f.三環(huán)唑(3.49 min);g.氧化樂果(1.99 min)；h.乙酰甲胺磷(1.50 min)

2.4 線性方程和檢出限取“1.3”中所配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.5”和“1.6”的儀器條件下按濃度由低到高的順序依次進(jìn)樣測定，以目標(biāo)化合物各組分定量離子峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、以其對(duì)應(yīng)的系列濃度為橫坐標(biāo)(X)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明(表2)，8種農(nóng)藥在0.1～100.0 μg/L線性關(guān)系良好(R2≥0.995)，且8種農(nóng)藥的檢出限均為0.1 μg/kg，定量限均為0.4 μg/kg。

表2 8種農(nóng)藥成分的線性方程和檢出限

2.5 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)取某農(nóng)藥場地土壤樣品，用8種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)后制備成濃度為1 μg/kg的加標(biāo)樣6份，經(jīng)前處理后，上機(jī)測定，計(jì)算6次平行測定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和加標(biāo)回收率。結(jié)果表明(表3)，8種農(nóng)藥成分的RSD在0.709%～2.740%，加標(biāo)回收率在82.4%～109.0%，表明該方法的加標(biāo)回收率和精密度良好。

表3 土樣中8種農(nóng)藥成分的精密度和加標(biāo)回收率(n=6)

2.6 實(shí)際樣品定量分析采集某農(nóng)藥場地土壤樣品進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，萎銹靈的濃度為0.6 μg/kg，加標(biāo)回收率為85.0%；三環(huán)唑的濃度為0.7 μg/kg，加標(biāo)回收率為104.0%;其他目標(biāo)化合物均未檢出。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，滿足土壤中多種農(nóng)藥殘留定量檢測的要求。

3 結(jié)論

該研究建立了可同時(shí)測定土壤中8種農(nóng)藥殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法。用0.1%甲酸-乙腈溶液提取，用PSA/C18吸附劑凈化，以乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，同時(shí)完成8種農(nóng)藥殘留的定性定量分析。該方法操作簡便、經(jīng)濟(jì)高效、靈敏度高，具有良好的精密度、準(zhǔn)確度和線性關(guān)系，適用于土壤中多種農(nóng)藥殘留量的檢測，為土壤中多種農(nóng)藥殘留的實(shí)時(shí)監(jiān)測提供依據(jù)。