超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定土壤中農(nóng)藥殘留

湯 瑩

(實樸檢測技術(shù)(上海)股份有限公司，上海 201108)

我國一直注重農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中投入了大量農(nóng)藥，其對消除病蟲害、鏟除雜草、增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)量作出了極大的貢獻[1-2]。然而，農(nóng)藥的使用給人類帶來極大利益的同時也會帶來很多副作用。絕大多數(shù)農(nóng)藥是有毒的化學(xué)物質(zhì)，長期大量使用不僅對農(nóng)副產(chǎn)品的安全、人畜的健康等形成潛在威脅，還會對環(huán)境造成污染。隨著農(nóng)藥使用量的增加，土壤環(huán)境中殘留的農(nóng)藥污染日益嚴重。對土壤進行農(nóng)藥分析檢測是目前研究土壤、保護土壤安全唯一的確定方法。土壤中農(nóng)藥的殘留濃度為痕量級，采用高效快速方便的方法檢測土壤中的農(nóng)藥殘留顯得非常有必要[3-4]。

三環(huán)唑(tricyclazole)是防治稻瘟病專用殺菌劑，屬于噻唑類，作為一種黑色素生物合成抑制劑，它可以通過抑制附著孢黑色素的生成，來抑制孢子萌發(fā)和附著孢形成，從而達到阻止病菌侵入或減少稻瘟病菌孢形成的目的；目前該農(nóng)藥已經(jīng)在印度被禁用[5-7]。萎銹靈(carboxin)是一種具有內(nèi)吸作用的雜環(huán)類殺菌劑，主要用于防治禾谷類作物黑穗病，其對人畜毒性較低，但不可與眼睛接觸；經(jīng)萎銹靈處理過的種子不可食用或飼用[8-10]。福美雙(thiram)可作為內(nèi)吸性殺菌劑復(fù)配劑的伴藥，屬二硫代氨基甲酸酯類保護性廣譜殺菌劑，主要用于處理種子和土壤，防治禾谷類黑穗病和多種作物的苗期立枯病等[11-13]；該化合物屬于歐盟內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)優(yōu)先分類的第1類，已在28個國家禁用。唑螨酯(fenpyroximate)是一種高效、廣譜、非內(nèi)吸性的苯氧基吡唑類殺螨劑，廣泛用于果蔬害螨防治，主要以觸殺等作用方式達到殺螨的目的[14-15]。芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl)是一種磺酰脲類除草劑，主要應(yīng)用于水稻田等雜草防除，具有高效、低毒等特點，對于目標雜草如闊葉類雜草和莎草具有強烈的生長抑制作用[16-17]。實際應(yīng)用中，水田和旱地相互輪作，因此這5種農(nóng)藥可能會在土壤和農(nóng)作物中同時殘留。同時分離檢測三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆的方法鮮見報道，因此該研究探討并建立了同時測定土壤中三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆的LC-MS/MS分析方法，以期滿足土壤中三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器。Xevo TQ-S micro三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；ME104E/02型電子天平(瑞士梅特勒公司)；SB25-12DT型實驗室超聲波式清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TD5M離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；SK-1漩渦混合器(江蘇中大儀器廠)；FilterUnit濾膜(0.22 μm,Agela Technologies公司)；Milli-Q超純水機(Millipore公司)。

1.1.2試劑與藥劑。三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆，純品型標準品，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、乙腈，均為高效液相色譜法級別，美國Thermo fisher公司；甲酸，質(zhì)譜級，美國Thermo fisher公司；超純水，Millipore公司；N-丙基乙二胺(PSA，40～63 μm，6 nm)，Agela Technologies公司；C18吸附劑，德國CNW公司；石墨化碳(GCB)，Agela Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1樣品處理。稱取10 g(精確至0.01 g)土壤樣品至50 mL具塞聚丙烯離心管中，加入適量硅藻土研磨均勻，加10 mL乙腈渦旋振蕩2 min，放置于超聲波清洗機中超聲20 min后，4 000 r/min離心3 min。取出離心管，取其上清液3 mL，加入至預(yù)先裝有凈化劑(300 mg無水硫酸鎂、150 mg C18和150 mg PSA)的10 mL具塞離心管中，渦旋振蕩2 min，8 000 r/min離心3 min后，過0.22 μm濾膜，待檢測。

1.2.2標準溶液的配制。

1.2.2.1單一標準儲備液。分別稱取適量的5種農(nóng)藥標準品置于5個容量瓶中，用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)稀釋定容至刻度，得到濃度為10 mg/L的各農(nóng)藥單一標準儲備液。

1.2.2.2混合標準儲備液。移取濃度為10 mg/L的5種單一農(nóng)藥標準儲備液各1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)稀釋定容至刻度，得到5種濃度均為1 mg/L的混合農(nóng)藥標準儲備液。

1.2.2.3標準工作曲線測定。分別移取1 mg/L的混合農(nóng)藥標準儲備液500、100、50、10、5、1 μL到6個10 mL容量瓶中，用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)定容，得到6個不同濃度的混合標準溶液，5種農(nóng)藥濃度分別是50.0、10.0、5.0、1.0、0.5和0.1 μg/L。

1.2.3儀器條件。色譜條件：選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進樣量1 μL；流動相為乙腈(A相)、0.1%甲酸水溶液(B相)，流動比例相梯度及流速情況見表1。質(zhì)譜條件：掃描方式為正離子掃描模式(ESI+)；數(shù)據(jù)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。碰撞氣體為氬氣；脫溶劑氣為高純N2?；衔锏谋O(jiān)測離子對(m/z)、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見表2。

表1 流動相梯度及流速

表2 5種農(nóng)藥的質(zhì)譜分析條件

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1萃取溶劑的選擇。理想的萃取溶劑可以將目標化合物有選擇性地轉(zhuǎn)移到溶劑中，不僅可以對目標化合物進行有效提取，還可以規(guī)避非目標化合物進入到萃取劑中，減少了樣品基質(zhì)的干擾。由于三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆這5種農(nóng)藥有較大的物理化學(xué)性質(zhì)差別，選用的萃取溶劑應(yīng)對這5種化合物具有顯著的溶解能力，并且對樣品基質(zhì)中其他的組分不溶或者少溶。該研究考察了丙酮、正己烷、乙酸乙酯和乙腈4種萃取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，當用丙酮作為萃取溶劑時，大部分農(nóng)藥的回收率在78.2%～90.2%，而萎銹靈的回收率為68.8%，回收率偏低；當用正己烷作為萃取溶劑時，三環(huán)唑的回收率為67.1%，唑螨酯的回收率為59.9%，芐嘧磺隆的回收率為65.6%，回收率偏低；當用乙酸乙酯和乙腈作為萃取溶劑時，回收率為78.5%～90.6%，總體表現(xiàn)較好，但乙酸乙酯作為萃取溶劑時，共提取物較多，雜質(zhì)干擾較大，因此，選擇乙腈作為萃取溶劑。

表3 萃取溶劑比較

2.1.2凈化方式的選擇。簡單、快速的前處理凈化方法有助于更準確地獲得樣品中農(nóng)藥的實際殘留量。該試驗中，土壤樣品經(jīng)萃取溶劑提取后，利用凈化劑將提取液進行凈化，凈化后的溶液過0.22 μm濾膜后直接上機檢測。凈化劑由無水硫酸鎂、PSA和C18組成，其中無水硫酸鎂用于除去提取液中的水分。由于PSA粉末極易吸水，吸水之后對其他分子的吸附能力會顯著下降，因此加入無水硫酸鎂可以規(guī)避PSA因吸水而導(dǎo)致性能下降。PSA可以利用氫鍵吸附去除提取液中的極性化合物雜質(zhì)，使樣品達到凈化。只加入無水硫酸鎂和PSA時樣品回收率較高，但基質(zhì)中非極性雜質(zhì)凈化效果不好，故加入C18目的是去除部分脂溶性或其他非極性雜質(zhì)。試驗發(fā)現(xiàn)，采用300 mg無水硫酸鎂、150 mg PSA和150 mg C18凈化3 mL 土壤提取液，可有效去除基質(zhì)中部分極性化合物、非極性脂肪和脂溶性雜質(zhì)等共提物，保證凈化效果并降低了后期質(zhì)譜離子源等的維護成本。

2.1.3萃取方式的選擇。該試驗于空白的土壤樣品中加入最終濃度為10 μg/L的混合標準溶液，以加標回收率為指標，考察振蕩萃取法和超聲萃取法對土壤樣品中5種農(nóng)藥殘留提取效率的影響，其他條件保持一致。振蕩萃取采取的是將樣品管固定在振蕩器上振蕩的方式。結(jié)果見表4。從表4可以看出，超聲萃取法提取時5種農(nóng)藥提取效果更高。振蕩萃取回收率低可能是因為在萃取過程中萃取液有一定的損失，萃取劑和溶劑未充分接觸、振蕩不充分等原因也有可能造成萃取率低。超聲萃取可以使萃取劑和溶液充分接觸，而且省時省力，能夠同時處理多個樣品。因此，該試驗采用超聲萃取法萃取樣品。

表4 萃取方式比較

2.2 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化當采用乙腈-水作為流動相時，5種農(nóng)藥質(zhì)譜響應(yīng)較弱；采用乙腈-水(甲酸)作為流動相體系，目標物質(zhì)得到了良好分離，質(zhì)譜響應(yīng)較強。該研究以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，對流動相的比例和洗脫梯度進行優(yōu)化。結(jié)果表明，采用表1所示的流動相濃度和梯度洗脫條件可得到較好的峰形和分離效果。

利用5種農(nóng)藥濃度為1 mg/L的混合標準溶液，對三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆的質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，參數(shù)包括母離子和子離子、錐孔電壓、碰撞能量、毛細管電壓、脫溶劑溫度和氣體流量。試驗結(jié)果表明，在ESI源正離子模式下，5種農(nóng)藥分子較易結(jié)合H+。質(zhì)譜儀調(diào)諧，優(yōu)化MRM參數(shù)使各農(nóng)藥特征碎片離子的強度達到最大。圖1為參數(shù)優(yōu)化后5種農(nóng)藥多離子反應(yīng)檢測總離子流圖。

注：1.三環(huán)唑；2.福美雙；3.萎銹靈；4.唑螨酯；5.芐嘧磺隆

2.3 線性關(guān)系考察按“1.2.3”色譜條件對5種農(nóng)藥進行測定，以峰面積對相應(yīng)濃度進行線性回歸。測定結(jié)果顯示，在0.1～50.0 μg/L峰面積(Y)與樣品濃度(X)呈良好的線性相關(guān)性(R2≥0.995)。按照HJ 168—2020計算檢測方法的檢出限和定量限。5種農(nóng)藥的線性回歸方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限見表5，各目標分析物的檢出限為0.009～0.022 μg/kg，定量限為0.038～0.088 μg/kg。

表5 5種農(nóng)藥的標準曲線、檢出限和定量限

2.4 回收率與精密度試驗以不含目標分析物的土壤樣品作為空白樣品，對該方法進行驗證?？疾炝藵舛葹?和10 μg/kg的添加水平，使用已知濃度的混合標準樣品溶液加入空白試樣中，然后按照“1.2.1”的操作步驟進行提取、凈化，重復(fù)試驗6次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表6)，該方法的加標回收率為71.9%～114.0%，相對標準偏差(RSD)為3.9%～8.3%，符合土壤實際檢測的需求。

表6 5種農(nóng)藥的回收率和精密度(n=6)

2.5 實際樣品分析利用該研究建立的方法，對45份土壤樣品進行分析，結(jié)果見圖2。采樣區(qū)域內(nèi)土壤中除福美雙和萎銹靈外，其余農(nóng)藥檢出率都比較低。福美雙檢出率最高，為95.6%，大部分土壤樣品中福美雙的檢出量都較低，但有8批土壤樣品福美雙的含量較高，分別為11.43、13.71、14.92、30.29、34.31、57.34、59.70、75.84 μg/kg；萎銹靈檢出率為86.7%，大多數(shù)土壤樣品中萎銹靈檢出量都較低，有4批土壤樣品萎銹靈含量較高，分別為25.64、26.00、29.37、201.60 μg/kg。三環(huán)唑檢出率為31.1%，檢出量都比較低，最高的檢測值為2.76 μg/kg；唑螨酯檢出率為15.6%，檢出量都比較低，最高的檢測值為3.19 μg/kg；芐嘧磺隆未檢出。

圖2 土壤樣品檢出率

福美雙和萎銹靈在采樣地區(qū)使用較為頻繁。三環(huán)唑、福美雙、唑螨酯均有不同程度的檢出，福美雙的檢出率更是達95.6%，說明該采樣地區(qū)土壤存在較大的安全風(fēng)險。

3 結(jié)論

該研究用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對土壤中三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆進行同時測定。樣品加入適量硅藻土研磨均勻后，經(jīng)乙腈超聲提取，離心分層并取上清液經(jīng)吸附劑凈化，以乙腈和0.1%乙酸水溶液梯度洗脫，利用ACQUITY UPLC BEH C18柱進行分離，正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描測定，實現(xiàn)了5種農(nóng)藥的分離和測定。該方法簡單快速、試劑消耗少，能滿足土壤中三環(huán)唑、福美雙、萎銹靈、唑螨酯和芐嘧磺隆同時測定的要求，具有一定的應(yīng)用價值。