基于線粒體COⅠ基因滁州地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

余紅喜，劉 帆，朱國美，任信林，劉鑫鑫，凌武海，蘇時萍*

(1.滁州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村技術(shù)推廣中心,安徽滁州 239000；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，隸屬甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬，俗稱小龍蝦。自20世紀(jì)30年代傳入我國，在長江流域擴(kuò)繁[1]，其味道鮮美，高蛋白低脂肪[2]，生命力頑強(qiáng)，適應(yīng)性廣，繁殖能力強(qiáng)，對水質(zhì)要求不高，現(xiàn)已遍布于我國中東部地區(qū)十余省[3]，成為我國稻田養(yǎng)殖的主要品種，養(yǎng)殖面積總量大，產(chǎn)量居淡水蝦類之首[4]。由于近幾年克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積和規(guī)模不斷擴(kuò)大，受其逆向選擇及種苗自繁自育的養(yǎng)殖模式等人為因素的影響，使得克氏原螯蝦個頭逐年變小，病害頻發(fā)，種質(zhì)退化嚴(yán)重，群體遺傳多樣性受到嚴(yán)峻考驗[5]。為了恢復(fù)與保護(hù)克氏原螯蝦種質(zhì)資源，提供優(yōu)良品種的選育科學(xué)依據(jù)，并提高經(jīng)濟(jì)效益，研究克氏原螯蝦遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。

線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是保守的共價閉合的雙鏈DNA分子，具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、無重組、多拷貝、母系遺傳等特點。線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COⅠ)作為蛋白編碼基因的一員，在分子標(biāo)記上是研究最為清楚的線粒體基因之一，也有學(xué)者認(rèn)為，相比其他線粒體基因，COⅠ基因是更為理想和常用的分子標(biāo)記[6]。徐浩文等[7]分析了8個地理種群紅條毛膚石鱉COⅠ基因的遺傳多樣性，單倍型遺傳多樣性數(shù)據(jù)顯示，多樣性數(shù)值較高，核苷酸多樣性較低，結(jié)果表明，紅條毛膚石鱉北方群體的遺傳多樣性與南方群體存在差異，2個群體應(yīng)該分別采取相應(yīng)措施來保護(hù)遺傳多樣性；李大命等[8]基于線粒體COⅠ基因序列分析江蘇省4個太湖新銀魚群體遺傳多樣性，結(jié)果表明4個太湖新銀魚種群偏離中性進(jìn)化，歷史上經(jīng)歷過種群擴(kuò)張；劉士力等[9]分析了紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體線粒體COⅠ基因序列的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，5個紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性存在差異，群體間存在著一定的基因交流；軒中亞等[10]基于線粒體COⅠ序列分析中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體與野生群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)野生中華絨螯蟹遺傳多樣性較低，尤其是在長江水系，不同地理群體之間的種質(zhì)混雜情況較為嚴(yán)重，反映了過度捕撈對種質(zhì)資源的極大破壞。然而，有關(guān)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體線粒體COⅠ基因序列遺傳多樣性的研究鮮見報道。

安徽省滁州市稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦至今已有25年，養(yǎng)殖群體分布廣泛，也是最早開展克氏原螯蝦苗種繁育的地區(qū)之一，以該地區(qū)為代表，研究克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性具有良好的代表性。筆者基于線粒體COⅠ基因序列，分析了安徽滁州市8個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)，探究其養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀，為更高效地開發(fā)利用安徽省克氏原螯蝦種質(zhì)資源及開展種質(zhì)資源評估提供參考依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料樣品采自安徽省滁州市，分別為全椒縣潘氏生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司(F1)、全椒縣赤鎮(zhèn)龍蝦經(jīng)濟(jì)合作社(F2)、全椒縣金順家庭農(nóng)場(F3)、全椒縣銀花家庭農(nóng)場(F4)、定遠(yuǎn)縣曹永明家庭農(nóng)場(F5)、定遠(yuǎn)錦鴻種養(yǎng)殖專業(yè)合作社(F6)、定遠(yuǎn)縣成海家庭農(nóng)場定遠(yuǎn)成海生態(tài)農(nóng)場(F7)、定遠(yuǎn)縣許令國生態(tài)種養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(F8)，共8個群體200個樣本。取其背部肌肉組織置于95%乙醇中，4 ℃保存，用于線粒體DNA抽提。

1.2 試驗方法

1.2.1線粒體DNA的抽提。肌肉組織使用YEASEN動物組織直接PCR試劑盒抽提DNA，-20 ℃保存。

1.2.2COⅠ序列的擴(kuò)增、測序。COⅠ引物序列[11]：LCO1490:5′-GGTCAA CAAATCATAAAGATATTGG -3′;HC02198:5′- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA -3′，委托上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。 PCR反應(yīng)體系為40 μL，包括2×Tissue Direct PCR Mix 20 μL，20 mol/L上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至 40 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)；最后一個循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳初步確定片段長度后，由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化、測序。

1.2.3遺傳多樣性和群體分化分析。序列的比對、堿基組成、遺傳距離使用MEGAX[12]進(jìn)行分析。序列的變異位點、核苷酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd)、分化系數(shù)(FST)使用DNAsp 5.0[13]進(jìn)行分析。

1.2.4群體結(jié)構(gòu)分析。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖使用POPART[14]構(gòu)建。鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGAX[12]構(gòu)建，并進(jìn)行1 000次的Bootstrap檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性和群體分化分析COⅠ測序數(shù)據(jù)經(jīng)人工校正、比對、去除兩端冗余序列和BLAST驗證序列同源性后，共獲得182條長度為655 bp的COⅠ序列用于下游分析，182條序列共檢出25個變異位點，包括15個簡約信息位點和10個單堿基變異位點；堿基平均含量為T(40.0%)，C(13.0%)，A(27.0%)和G(20.0%)，具有明顯的(A+T)堿基偏倚。遺傳多樣性分析顯示(表1)，多數(shù)群體具有較低的單倍型多樣性(0.13 ～0.41 < 0.50)，僅F7組擁有較高的單倍型多樣性(Hd=0.82)。核苷酸多樣性與單倍型多樣性趨勢一致，但所有群體均較低?？傮w來說，8個群體整體呈現(xiàn)低單倍型多樣性及低核苷酸多樣性的遺傳多樣性現(xiàn)狀。

表1 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)

群體分化分析顯示(表2)，8個養(yǎng)殖群體間發(fā)生了不同程度的分化，從輕微分化(FST<0.05)到中等分化(0.05

表2 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的FST(對角線下)與群體間遺傳距離(對角線上)

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示(圖1)，個體并未按照養(yǎng)殖群體地理位置分布聚集成相應(yīng)的分支，反而混雜在一起，且個體間遺傳距離較近。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示(圖2)，共檢出26種單倍型，其中，Hap_1、Hap_2、Hap_4、Hap_7、Hap_15為多群體共享單倍型；Hap_2在群體共享單倍型中占主要分布，其余均為群體內(nèi)獨有單倍型；F7組群體擁有最多的單倍型(12個)。單倍型的分布方式與系統(tǒng)發(fā)育樹趨勢相同，并未依據(jù)地理位置而聚集，而是通過Hap_2替換數(shù)個堿基后相連接，多數(shù)單倍型為群體內(nèi)部獨有。

圖1 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹

注：圓圈面積大小代表單倍型頻數(shù)，不同的顏色代表不同的群體，豎線代表突變位點

3 討論

3.1 序列特征與遺傳多樣性分析COⅠ基因進(jìn)化速度快，引物通用性強(qiáng)，堿基替換速率快，被廣泛應(yīng)用于群體遺傳變異及系統(tǒng)進(jìn)化等研究[15]。該研究共獲得8個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體182條，COⅠ區(qū)序列約為655 bp。堿基T、C、A、G 的平均含量為T(40.0%)，C(13.0%)，A(27.0%)和G(20.0%)，其中A+T(67.0%)高于C+G(33.0%)，呈現(xiàn)明顯的AT堿基偏倚，符合脊椎動物線粒體堿基構(gòu)成的一般特征[16]。

遺傳多樣性是生物適應(yīng)與進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)，用于評價物種進(jìn)化潛能與健康狀況，豐富的遺傳多樣性使得物種能夠更好地適應(yīng)環(huán)境，擁有巨大的進(jìn)化潛力。人工養(yǎng)殖的動物常因親本基數(shù)不足，難以避免近交，產(chǎn)生奠基者效應(yīng)，加速遺傳漂變，使得遺傳多樣性迅速丟失。核苷酸多樣性指數(shù)和線粒體DNA 的單倍型多樣性指數(shù)是衡量DNA 多態(tài)程度的2個重要指標(biāo)。8個群體的遺傳多樣性指數(shù)表現(xiàn)為較低的單倍型多樣性(Hd=0.37)與較低的核苷酸多樣性(Pi=0.001 72)，表明滁州地區(qū)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較低，需要改良育種措施和育種方法。

3.2 遺傳分化和群體結(jié)構(gòu)群體間的遺傳距離是衡量群體遺傳分化的重要指標(biāo)[17]。利用遺傳距離數(shù)值定量估計了物種不同分類單位間的遺傳分化水平，種群間遺傳距離值為0～0.05，亞種間是0.02～0.20。該研究中8個克氏原螯蝦群體間的遺傳距離均在0.05 以下，且 MGEA軟件聚類分析發(fā)現(xiàn)，8個群體均為混合聚類，說明8個群體之間的遺傳分化處于群間水平。

群體遺傳學(xué)研究認(rèn)為，F(xiàn)ST值可以表示群體間的分化程度，根據(jù)Wright[18]的劃分標(biāo)準(zhǔn)可分為：0～0.05，無分化；>0.05～0.15，中度分化；>0.15 ～ 0.25，高度分化；>0.25，重度分化。該研究8個群體間的FST為-0.023 56～ 0.122 14，F(xiàn)7組與F1組群體間的遺傳分化系數(shù)為0.122 14，表現(xiàn)為中度遺傳分化；F6組與F8組群體間分化最弱。同樣地，在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示出與系統(tǒng)進(jìn)化樹相似的結(jié)果，8個群體的單倍型并未依照地理位置聚集，反而以Hap_2為主要共享單倍型，其余單倍型通過數(shù)個堿基的替換演變成群體內(nèi)部獨有單倍型。

4 結(jié)論

綜上所述，該研究基于能夠反映種群間遺傳多樣性的線粒體COⅠ為分子標(biāo)記，分析了8個安徽省滁州市克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，8個群體的遺傳多樣性較低，群體結(jié)構(gòu)為輕微程度的分化，群體間遺傳 距離較小，不足以認(rèn)定為群體間有差異。因此，在后續(xù)的繁殖與選育工作中，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對遺傳背景的篩查，避免因遺傳背景的相似，造成克氏原螯蝦遺傳多樣性的進(jìn)一步丟失，進(jìn)而影響克氏原螯蝦養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。