甘薯脫毒種苗無糖培養(yǎng)的影響因素研究

陳 順，許玉嬋，官錦燕，羅劍飄，陳雙艷，羅 藝，羅青文，譚嘉娜*

(1.廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所湛江研究中心，廣東湛江 524300；2.崇左市江州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，廣西崇左 532200)

植物無糖培養(yǎng)技術(shù)，又稱光自養(yǎng)微繁殖技術(shù)，是以CO2代替常規(guī)組織培養(yǎng)中的糖源作為植物生長所需的碳源，并通過控制影響植株生長的環(huán)境因子(如溫度、濕度、光照強度、CO2濃度等)使植株由兼養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型，低成本生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗的一種植物組織培養(yǎng)技術(shù)[1-3]。該技術(shù)于1997年引進我國[4]，近年來已廣泛應(yīng)用于作物快速繁殖[4-5]。在該技術(shù)培養(yǎng)下的植株生長發(fā)育快，培養(yǎng)周期縮短40%以上[1]，顯著提高了種苗質(zhì)量，綜合成本平均降低了30%[6]。楊玉田等[7]研究表明，甘薯無糖培養(yǎng)苗較對照葉片增大，葉色濃綠，幼苗茁壯，移栽后成活率達(dá)到95%。由于無糖狀態(tài)下外植體需要進行自養(yǎng)生長，要求外植體具有一定的形態(tài)大小，這就決定了無糖組織培養(yǎng)所取用的材料為繼代苗，適用于組培的壯苗生根培養(yǎng)[8]。筆者利用建立的無糖培養(yǎng)體系，研究培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)液成分與體積、光照強度與光照時間及植株的完整性等因子對甘薯無糖培養(yǎng)期間生長情況的影響，以期提高組培種苗馴化期間的質(zhì)量和成活率，進一步細(xì)化和提升甘薯脫毒種苗的工廠化無糖培養(yǎng)效率。

1 材料與方法

1.1 材料以廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所湛江研究中心的甘薯脫毒組培苗作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1甘薯脫毒苗的接種。在超凈工作臺上，將滅菌后的培養(yǎng)基質(zhì)倒入已滅菌的無糖培養(yǎng)盒中，基質(zhì)厚度約3 cm，倒入1 000 mL營養(yǎng)液，將傳統(tǒng)組織培養(yǎng)20～30 d的甘薯組培苗取出，無菌水洗凈基部殘留的培養(yǎng)基，將甘薯組培苗按80株/盒的規(guī)格接種。對照組使用同批次傳統(tǒng)組培生根苗。

1.2.2甘薯脫毒苗無糖培養(yǎng)條件。將接種后的培養(yǎng)盒連接無糖培養(yǎng)裝置，在溫度為(27±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為10 h/d，濕度為50%～65%，空氣中CO2濃度為400～600 mg/m3的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)處理設(shè)置見表1，每處理3組平行試驗，定期觀察并記錄甘薯組培苗的生長狀況。經(jīng)過無糖培養(yǎng)后，測量培養(yǎng)苗的株高和莖粗，并移栽置溫度為(28±1) ℃的溫室大棚進行種植。對照組使用同批次傳統(tǒng)組培苗袋裝苗，對照組和試驗組同時進行培養(yǎng)，控制培養(yǎng)的環(huán)境條件一致，培養(yǎng)時間一致，進行3組平行試驗。

表1 無糖培養(yǎng)中培養(yǎng)條件的控制

1.2.3營養(yǎng)液成分對植株的影響。設(shè)計3種無糖培養(yǎng)液成分：①MS(有機物)+抑菌劑0.67 g/L；② MS(有機物)+花寶2號0.1 g/L+抑菌劑0.67 g/L；③ MS(有機物)+NAA 0.1 g/L+IBA 0.1 g/L+抑菌劑0.67 g/L。在上述試驗后，設(shè)計營養(yǎng)液單一營養(yǎng)成分的梯度試驗(表2)，以T3處理作為基準(zhǔn)，探究每升培養(yǎng)液中適合無糖培養(yǎng)下植株生長的營養(yǎng)成分組合方案。

表2 培養(yǎng)液成分梯度試驗

1.2.4植株的完整性對繁殖的影響。采用良種植株，分別為帶有根系的甘薯脫毒繼代苗和切除根系的甘薯脫毒繼代苗，并進行無糖培養(yǎng)。

1.2.5培養(yǎng)液體積對植株的影響。在無糖培養(yǎng)試驗中，添加的營養(yǎng)液體積梯度設(shè)置為900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400 mL。通過培養(yǎng)液體積的梯度試驗，探究最適營養(yǎng)液體積。

1.2.6不同培養(yǎng)基質(zhì)對植株的影響。采用黃金蛭石、椰糠、沙子、泥炭土、珍珠巖物種基質(zhì)以體積比1∶1混合，設(shè)計10種不同搭配的培養(yǎng)基質(zhì)：①沙子與珍珠巖(CK)； ②沙子與蛭石；③沙子與泥炭土；④沙子與椰糠；⑤珍珠巖與蛭石；⑥珍珠巖與泥炭土；⑦珍珠巖與椰糠；⑧蛭石與泥炭土；⑨蛭石與椰糠；⑩泥炭土與椰糠。

1.2.7光照強度對植株的影響。設(shè)計3個光照強度條件，研究光照強度對植株生長的影響。條件如下：①1根28 W日光燈(光照強度為2 000 lx)②2根28 W日光燈(光照強度為2 400 lx)③3根28 W日光燈(光照強度為2 900 lx)。對照(CK)為常規(guī)培養(yǎng)方式，光照強度為2 000 lx。

1.2.8光照時長對植株的影響。該試驗針對光照時長設(shè)計了光照時長梯度試驗，條件如下：8、9、10、11、12、13 h/d。對照(CK)為常規(guī)培養(yǎng)方式，光照時長為8 h。

1.2.9正交試驗優(yōu)化營養(yǎng)液成分組合。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在不考慮各因素間的交互作用，將培養(yǎng)液成分中3個因素進行正交試驗，每升培養(yǎng)液中各成分最優(yōu)3因素3水平設(shè)計見表3。

表3 培養(yǎng)液成分優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)正交表L9(34)安排試驗，分別為：A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B3C2、A3B1C3、A3B2C1。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭土與珍珠巖(1∶1)，培養(yǎng)液體積為1 200 mL，植株帶有根系，選擇3根28 W日光燈(光照強度為2 900 lx)，光照時長為12 h/d，溫度為(27±2) ℃，濕度為50%～65%(盒內(nèi)濕度80%～95%)，CO2濃度為400～600 mg/m3。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)液成分對植株的影響通過單因素方差分析方法分析了植株的株高和莖粗在不同培養(yǎng)液成分方案中的差異，結(jié)果見圖1、2。從圖1、2可見，各處理之間的株高和莖粗均存在顯著性(P<0.05)，3種無糖培養(yǎng)液方案的株高和莖粗均顯著高于CK，表現(xiàn)為T2>T3>T1>CK，可見，T2處理促進甘薯植株的生長效果最好。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；CK為常規(guī)組織培養(yǎng)

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；CK為常規(guī)組織培養(yǎng)

通過單因素方差分析方法，分析了培養(yǎng)液成分中大量元素母液、微量元素母液和鐵鹽母液體積量對甘薯脫毒苗植株的高度和莖粗的影響，結(jié)果見表4～6。由表4可知，當(dāng)大量元素母液體積為50 mL時，甘薯脫毒苗株高顯著高于其他體積處理；而體積為40、50和60 mL時，植株莖粗均顯著高于CK，由此可知，大量元素母液體積量40、50和60 mL為該單因素試驗的適宜水平。

表4 大量元素母液對植株高度和莖粗的影響

由表5可知，當(dāng)微量元素母液體積量為3 mL時，株高顯著高于其他體積處理，而體積量為1、3和7 mL時，植株的莖粗顯著高于其他體積處理，但體積為3 mL時，植株的莖粗平均值相對最大，體積為5 mL時，植株生長正常，體積為7 mL時，植株長勢較弱，因此微量元素最適宜的3個水平體積分別為1、3和5 mL。

表5 微量元素母液對植株高度和莖粗的影響

由表6可知，當(dāng)鐵鹽母液體積量為3、9 mL時，甘薯脫毒苗株高顯著高于其他體積處理；而當(dāng)體積處理為3 mL時，莖粗大于體積為5和9 mL的植株，顯著高于CK。當(dāng)鐵鹽母液體積量為1、3和5 mL時，植株的葉片相對較大，葉色深綠，相對體積為7 mL處理的植株葉片較少。但體積為7 mL時，葉片較多，但較小，植株較矮小。由此可知，適宜的鐵鹽母液體積量分別為1、3和5 mL。

表6 鐵鹽母液對植株高度和莖粗的影響

2.2 植株完整性對繁殖的影響通過單因素方差分析的方法分析了植株的株高和莖粗在不同植株處理方式下的差異，結(jié)果見圖3。由圖3可知，接種的植株有根系時，株高顯著高于CK。由圖4可知，有根系的植株莖粗顯著大于無根系植株，無根系植株的莖粗顯著大于CK。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.3 培養(yǎng)液體積對植株的影響通過單因素方差分析對植株的株高和莖粗在不同培養(yǎng)液體積下的差異進行分析，結(jié)果見圖5、6。由圖5可見，培養(yǎng)液體積1 200 mL處理植株的株高與其他體積處理均具有顯著性差異(P<0.05)，株高顯著高于其他培養(yǎng)液體積處理的株高。由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)液體積為1 000和1 200 mL時[莖粗分別為(1.40±0.09)、(1.41±0.06) mm]，植株莖粗顯著高于其他處理。因此，培養(yǎng)液體積為1 200 mL對植株的生長影響效果最好。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.4 不同培養(yǎng)基質(zhì)對植株的影響通過單因素方差分析對植株的株高和莖粗在不同培養(yǎng)基質(zhì)下的差異進行分析，結(jié)果見圖7、8。由圖7可知，甘薯脫毒種苗在各種培養(yǎng)基質(zhì)中的株高各不相同，每個處理均存在光照不均勻現(xiàn)象，在珍珠巖與泥炭土組合(處理⑥)的培養(yǎng)基質(zhì)中，甘薯種苗植株高度表現(xiàn)較好，顯著高于其他培養(yǎng)基質(zhì)下植株的高度。由圖8可知，處理⑥和處理⑩的植株莖粗較大，顯著大于其他處理組，處理③和處理⑧的植株莖粗也相對較大。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.5 光照強度對植株的影響由表7可知，隨著光照強度的增強，甘薯脫毒種苗植株的高度和莖粗也隨之增大。當(dāng)光照強度大于2 400 lx時，株高顯著高于低光照強度的植株高度。在不同光照處理下，莖粗無顯著差異，但光照強度越高，莖粗越大。因此，光照強度對甘薯植株的生長具有明顯的影響，且適宜光照強度為2 900 lx。

表7 光照強度對植株高度和莖粗的影響

2.6 光照時長對植株的影響通過單因素方差分析方法，對植株的株高和莖粗在不同光照時長下的差異進行分析，結(jié)果見圖9。從圖9可見，不同光照時長處理的植株高度均顯著高于CK。當(dāng)光照時長為12和13 h/d時，植株的高度顯著高于其他處理組，光照時長為12 h/d處理的株高最高，而且其數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。由圖10可知，8、9 h/d處理的植株莖粗與CK差異不顯著，光照時長為10、11、12和13 h/d處理與CK差異顯著。光照時長為10和11 h/d的植株莖粗較大，而光照時長為12和13 h/d處理的植株莖粗較小。綜上，最優(yōu)水平為光照時間12 h/d。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.7 正交試驗

2.7.1正交試驗結(jié)果。選擇培養(yǎng)液成分中的主要影響因素大量元素母液、微量元素母液和鐵鹽母液3個因素設(shè)計正交試驗，在不考慮3因素之間存在交互作用的情況下，正交試驗結(jié)果見表8、9。

2.7.2方差分析。由表8可知，以株高作為衡量指標(biāo)時，大量元素母液對株高的影響作用最大，鐵鹽母液影響作用次之，微量元素母液影響作用最小。培養(yǎng)液3種主要成分最優(yōu)組合為A2B2C2，大量元素母液體積量為50 mL，微量元素母液體積量為3 mL，鐵鹽母液體積量為3 mL。由表9可知，以植株莖粗作為衡量指標(biāo)時，大量元素母液對植株莖粗的影響作用最大，微量元素母液影響作用次之，鐵鹽母液影響作用最小。培養(yǎng)液3種主要成分最優(yōu)組合為A2B2C2，由此確定大量元素母液體積量為50 mL，微量元素母液體積量為3 mL，鐵鹽母液體積量為3 mL。

表8 株高正交試驗結(jié)果

表9 莖粗正交試驗結(jié)果

由表10可知，以株高作為衡量指標(biāo)時，在不考慮因素之間存在交互作用的情況下，3種因素對植株高度均無顯著影響，由F值大小可以看出因素主次順序為A>C>B。

表10 株高方差分析

由表11可知，以植株莖粗作為衡量指標(biāo)時，在不考慮因素之間存在交互作用的情況下，3種因素對植株的莖粗均無顯著影響，由F值大小可以看出因素主次順序為A>B>C。

表11 莖粗方差分析

3 討論

夏瑞等[9]的櫻桃李試管苗生根試驗研究結(jié)果表明，不含糖的土壤支撐培養(yǎng)基中試管苗的生根率達(dá)到90.0%，且其根長顯著高于含糖培養(yǎng)基。馮潔等[10]在馬鈴薯無糖培養(yǎng)過程中去除MS培養(yǎng)溶液中的有機成分，能夠降低污染。該研究設(shè)計了3種培養(yǎng)液方案，添加了大量元素、微量元素、鐵鹽母液和一定量的生長調(diào)節(jié)劑，節(jié)省了糖和有機物，可降低成本40%[6]。從植株的生長狀態(tài)和植株高度與莖粗對比，可以看出T3處理和T2處理明顯優(yōu)于T1處理，而根據(jù)衡量指標(biāo)數(shù)據(jù)的對比，T2處理優(yōu)于T3處理。除了考慮提高植株的吸收作用，培養(yǎng)液中各營養(yǎng)元素的合理搭配更為重要。從3種營養(yǎng)成分的梯度試驗可以看出，隨著體積的增大，植株的高度和莖粗呈拋物線曲線。說明在營養(yǎng)成分達(dá)到最適濃度前，營養(yǎng)液體積與株高和莖粗呈正相關(guān)；營養(yǎng)成分超過最適濃度后，營養(yǎng)液體積與株高和莖粗呈負(fù)相關(guān)。從正交試驗結(jié)果可知，每種營養(yǎng)成分的最優(yōu)水平組合的效果并不是最好的。在不考慮營養(yǎng)成分之間交互作用的情況下，進行直觀分析和方差分析得出，培養(yǎng)液中最優(yōu)組合為大量元素母液50 mL，微量元素母液3 mL，鐵鹽母液3 mL。由于營養(yǎng)成分之間存在交互作用，分析結(jié)果存在一定的局限性，但是該交互作用影響較小，這對今后進一步深入研究具有一定參考。

在接種苗的處理方式中，甘薯脫毒苗帶根系的培養(yǎng)效果優(yōu)于無根系處理和CK。說明植株存在根系更利于對培養(yǎng)液中的培養(yǎng)成分進行吸收，促進自身的生長發(fā)育。但是，無根系的植株仍能正常生長發(fā)育，并且比傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)效果好，故甘薯種苗接種過程中，有無根系的植株均可用于無糖培養(yǎng)，從而提高材料的利用率。

在培養(yǎng)液體積探究中，培養(yǎng)液體積過小和過大均不適合植株的生長發(fā)育。當(dāng)培養(yǎng)液體積過小時，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分和水分含量不足，難以滿足植株生長需求，使得植株的生長發(fā)育狀態(tài)欠佳。 當(dāng)培養(yǎng)液體積過大時，培養(yǎng)盒內(nèi)的水分溢出于培養(yǎng)基質(zhì)表面，植株根系一直處于浸泡狀態(tài)，水中缺乏空氣導(dǎo)致根系無法正常呼吸，易出現(xiàn)爛根現(xiàn)象，導(dǎo)致植株無法正常吸收培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分來促進自身生長發(fā)育，生長狀態(tài)較差。因此，合適的培養(yǎng)液體積有利于促進植株的生長發(fā)育，當(dāng)培養(yǎng)液體積量為1 200 mL時，植株的生長狀態(tài)最好。

傳統(tǒng)組培通常使用瓊脂、卡拉膠等凝膠性物質(zhì)作為基質(zhì)，植株根系發(fā)育比較細(xì)弱，移栽時易損傷。賈效成等[11]研究表明，無糖培養(yǎng)基質(zhì)對油茶及種苗成活率的影響顯著。在無糖培養(yǎng)中，通常使用黃金蛭石、珍珠巖、纖維素等多孔的無機材料作為培養(yǎng)基質(zhì)。由于其良好的透氣性，使得植株的根系氧氣充足，促進植株根系的發(fā)育，增加其韌性，且多孔基質(zhì)價格低廉，材料成本低。在培養(yǎng)基質(zhì)的探究試驗中，使用沙子、蛭石、泥炭土、珍珠巖和椰糠以體積比1∶1組合作為培養(yǎng)基質(zhì)。在泥炭土與珍珠巖的培養(yǎng)基質(zhì)中，植株的生長狀態(tài)和植株高度、莖粗均表現(xiàn)較好。一方面，泥炭土為植株提供額外的碳源，促進植株的生長發(fā)育；另一方面，珍珠巖為植株根系提供了適度的空間，提高培養(yǎng)基質(zhì)的透氣性，促進植株根系發(fā)育，使得植株在該培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)生長表現(xiàn)較好。

光是植物進行光合作用的主要能量來源，而無糖培養(yǎng)技術(shù)是依靠植株自身的光合作用進行轉(zhuǎn)化，供給自身生長發(fā)育消耗，且無糖組培苗有不需要經(jīng)過煉苗的優(yōu)勢[12]。楊玉田等[7]研究表明，脫毒甘薯18試管苗在光照強度為3 000 lx，光照16 h的環(huán)境下進行培養(yǎng)，取得了良好的培養(yǎng)效果。在光照強度對植株生長影響的研究中，由于試驗條件的限制，在空氣中CO2濃度為400～600 mg/m3的培養(yǎng)室內(nèi)，隨著光照強度的增加，植株的生長狀態(tài)也越來越好。說明培養(yǎng)容器內(nèi)的CO2濃度尚未達(dá)到植物CO2補償點，將CO2濃度和光照強度2個條件相結(jié)合繼續(xù)探究，可使植株的生長狀態(tài)得到進一步提高。試驗條件具有一定的限制性，最優(yōu)光照強度僅為2 900 lx。另外，光照時長對植株的生長狀態(tài)也具有很大的影響作用。該試驗中當(dāng)光照時長為12和13 h/d時，甘薯植株的生長狀態(tài)較好。但是，從衡量指標(biāo)數(shù)據(jù)分析結(jié)果來看，光照時長為12 h/d為該試驗的最優(yōu)光照時長。

4 結(jié)論

以甘薯脫毒種苗為試驗材料，建立無糖培養(yǎng)體系，替代傳統(tǒng)組培小容器培養(yǎng)方法，使用大容器培養(yǎng)盒進行培養(yǎng)，改善植株生長環(huán)境。通過單因素試驗和正交試驗的方法，探究最適合甘薯脫毒種苗的無糖培養(yǎng)條件，使其生長狀態(tài)達(dá)到最好。通過一系列的試驗結(jié)果表明，在進行種苗接種時，使用的脫毒甘薯種苗需帶有根系，可促進植株的生長發(fā)育。最優(yōu)的無糖培養(yǎng)液營養(yǎng)成分方案為MS+0.1 g/L花寶2號+0.67 g/L抑菌劑，其中MS培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分組合為大量元素母液(20倍濃縮液)50 mL、微量元素母液(200倍濃縮液)3 mL、鐵鹽母液(200倍濃縮液)3 mL。在無糖培養(yǎng)體系中，最優(yōu)的室內(nèi)培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭土與珍珠巖(1∶1)，培養(yǎng)液體積為1 200 mL，選擇3根28 W日光燈(光照強度為2 900 lx)，光照時長為12 h/d。無糖培養(yǎng)結(jié)束后，將植株移栽于珍珠巖與泥炭土(體積比1∶1)組合基質(zhì)的穴盆中培養(yǎng)。

該試驗探究了無糖培養(yǎng)技術(shù)在甘薯脫毒種苗繁育上的應(yīng)用情況，可為甘薯脫毒種苗進行無糖培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)提供一定的借鑒作用。