115份貴州茶樹種質(zhì)茶多酚及兒茶素多樣性分析及特異種質(zhì)篩選

楊 春，陳正武，喬大河，郭 燕，李 燕，梁思慧

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴陽 550006)

茶多酚是茶樹酚類物質(zhì)及其衍生物的總稱，是茶葉的重要品質(zhì)成分和構(gòu)成茶湯滋味的主要物質(zhì)[1]，約占茶葉干質(zhì)量的18.0%～36.0%[2]。兒茶素類化合物是茶樹茶多酚的主要組成成分，也是茶葉滋味和保健功效得以發(fā)揮的關(guān)鍵成分[3-4]，兒茶素賦予綠茶以濃厚的滋味，使綠茶具有苦澀味和收斂性[5-6]，在紅茶加工中氧化形成茶黃素、茶紅素等，對紅茶湯色和滋味品質(zhì)形成具有決定性作用[7]。茶樹中兒茶素組分主要有表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)和兒茶素(C)，茶樹新梢中不同兒茶素組分含量差異是判斷茶樹品種適制性的重要指標(biāo)[8-9]，同時也在一定程度上體現(xiàn)茶樹的進(jìn)化程度[10-11]。

茶多酚和兒茶素組分等多酚類物質(zhì)一直是茶樹種質(zhì)資源評價中生化成分分析的重點(diǎn)。段志芬等[12]分析100份云南野生茶樹資源兒茶素，發(fā)現(xiàn)兒茶素總量的變化區(qū)間最大，從1.86%到 18.20%；劉玉飛等[13]分析66份云南茶樹種質(zhì)兒茶素多樣性，并篩選出4份高兒茶素指數(shù)(CI)種質(zhì)；王治會等[14]和丁帥濤等[15]的研究發(fā)現(xiàn)江西和陜西茶樹資源中茶多酚含量相對較低，分別為 13.51%～23.97%和10.48%～24.15%，平均值分別為18.82%和16.34%。吳雨婷等[16]分析77份廣西地方茶樹種質(zhì)資源的茶多酚含量，從中篩選出茶多酚≥25.0%的特異高茶多酚茶樹種質(zhì)16份。

貴州擁有豐富的野生、半野生茶樹資源和地方群體品種[17-18]，前人研究中分析野生茶樹資源[19]、自選種質(zhì)[20]、地方茶樹資源[21]的茶多酚、兒茶素組分等生化組分進(jìn)行分析，并基于此對種質(zhì)進(jìn)行評價利用。但這些研究中或僅分析自選種質(zhì)或野生茶樹種質(zhì)，且樣本量較小，尚未將貴州地方茶樹種質(zhì)、自選種質(zhì)和野生種質(zhì)加以整合分析。

本研究以115份貴州茶樹種質(zhì)為研究材料，檢測分析以茶多酚、沒食子酸、兒茶素組分為代表的茶葉多酚類物質(zhì)，一方面通過數(shù)據(jù)分析得出貴州茶樹種質(zhì)多酚類物質(zhì)分布特點(diǎn)，另一方面可從中篩選出高茶多酚、高EGCG等特異種質(zhì)，為功能性茶葉產(chǎn)品開發(fā)提供優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜儀(美國安捷倫公司)，TU-1800 紫外可見分光光度計(北京普析)。

沒食子酸(Gallic acid,GA)、EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG標(biāo)準(zhǔn)品購自合肥博美生物科技有限公司，甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、冰乙酸等有機(jī)試劑為市售HPLC級。

1.2 材 料

115份種質(zhì)均取自貴州省內(nèi)，45份無性系材料保存于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所湄潭種質(zhì)資源圃，34份選自地方群體品種，36份為野生茶樹資源，具體信息見表1。

表1 115份茶樹種質(zhì)基本信息

1.3 樣品制備與試驗(yàn)方法

生化樣的制備采用微波殺青的方法[22]，于2020年3月-5月，按1芽2葉標(biāo)準(zhǔn)采摘鮮葉原料，微波殺青后烘干、粉碎，待用。

茶多酚含量測定參照GB/T 8313-2018中的福林酚比色法。沒食子酸和兒茶素組分含量參照周順珍等[23]的方法檢測。每個樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取3次平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 兒茶素類指標(biāo)計算 非酯型兒茶素[24](Non-ester catechins)=EGC+EC+C；酯型兒茶素[25](Ester catechins)=EGCG+GCG+ECG；兒茶素總量(Total catechins)=EGC+EC+C+EGCG+GCG+ECG；兒茶素占比(Catechins proportion)=兒茶素總量/茶多酚含量×100；兒茶素指數(shù)[26](Catechin index，CI)=(EC+ECG)/(EGC+EGCG)。

1.4.2 統(tǒng)計分析方法 采用香農(nóng)-維納指數(shù)(Shannon-Wiener index)[27-28]評價遺傳多樣性指數(shù)(H′)，采用SPSS 21.0進(jìn)行相關(guān)性分析和差異顯著性檢驗(yàn)，采用Origin 2021繪制正態(tài)分布直方圖，利用TBtools進(jìn)行聚類熱圖繪制[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 115份茶樹多酚類物質(zhì)基本統(tǒng)計參數(shù)和遺傳多樣性分析

貴州茶樹種質(zhì)中茶多酚、沒食子酸、EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG平均值分別為 18.57%、0.03%、1.08%、0.80%、0.95%、5.75%、2.92%和0.37%。非酯型兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量和兒茶素占比平均值分別是 2.83%、9.05%、11.88%和65.56%(表2)。結(jié)合各性狀含量變幅發(fā)現(xiàn)EGCG和ECG是兒茶素組分中含量變幅最大的，EGCG含量從0.00%到10.86%，ECG含量從0.71%到10.55%，表明貴州茶樹種質(zhì)中即存在EGCG和ECG含量較高的資源，又存在著EGCG和ECG含量極低的資源，進(jìn)一步說明貴州茶樹種質(zhì)資源的豐富性。

由表2可知，12個多酚類指標(biāo)變異系數(shù)為15.59%～198.23%，平均變異系數(shù)為69.79%，茶多酚、兒茶素總量和兒茶素占比變異系數(shù)較小，為15.59%、26.96%和27.56%；C和GCG變異系數(shù)較大，為198.23%和158.70%。說明貴州茶樹種質(zhì)間茶多酚、兒茶素總量和兒茶素占比相對較穩(wěn)定，而GCG和C變異程度較大。遺傳多樣性指數(shù)為0.691～2.040，平均為1.665，茶多酚和EGC遺傳多樣性指數(shù)較大，為2.040和2.009，C的遺傳多樣性最小，僅為0.691，結(jié)合變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)C相對于其他多酚類物質(zhì)變異程度最大、而多樣性指數(shù)最小，說明貴州茶樹種質(zhì)中C含量差異顯著、分布不均勻，呈現(xiàn)兩極化態(tài)勢。利用皮爾森(Pearson)相關(guān)系數(shù)分析12個多酚類指標(biāo)變異系數(shù)與多樣性指數(shù)間的關(guān)聯(lián)(表2)，發(fā)現(xiàn)兩者存在極顯著負(fù)相關(guān)，這與趙洋等[30]的研究結(jié)果一致，說明變異系數(shù)越大的性狀，其分布離散程度高，多樣性指數(shù)越小。

表2 115份茶樹資源茶多酚類物質(zhì)和兒茶素組分統(tǒng)計分析

2.2 115份茶樹資源多酚類物質(zhì)含量分布分析

2.2.1 茶多酚及兒茶素組分正態(tài)分布分析 結(jié)合正態(tài)直方圖、各性狀分布峰度和偏度等因素對115份貴州茶樹資源茶多酚及兒茶素組分進(jìn)行正態(tài)分布分析。結(jié)果顯示，12個生化性狀分布峰度為-0.51～19.19，偏度為-1.18～4.01，除沒食子酸和GCG外，其余10個性狀偏度和峰度絕對值均相對較小，基本符合正態(tài)分布特征(圖1, 表3)。

表3 115份茶樹資源12個多酚類指標(biāo)峰度和偏度分析

由圖1-A～1-C可知，茶多酚含量、兒茶素總量和兒茶素占比分布較為均勻，茶多酚含量主要分布為16.0%～18.0%，兒茶素總量主要分布為12.0%～14.0%，兒茶素占比主要分布為65%～85%，分別有31份、30份和74份。由圖1-D～1-F可知，沒食子酸、C和GCG在茶樹種質(zhì)中含量整體不高，且分布較為集中，115份茶樹資源中108份沒食子酸含量低于0.06%，99份C含量低于0.75%，94份GCG含量低于0.5%。

EGCG和ECG是茶樹中含量較為豐富的兒茶素單體，分別占茶葉中兒茶素組分的50%～60%和15%～20%[26]，由圖1-G、1-H可知，貴州茶樹種質(zhì)中EGCG含量分布較為特殊，存在含量較低和含量較高的兩個主要分布區(qū)間，一個分布區(qū)間是EGCG含量低于1.5%，另一個是EGCG含量為7.5%～9.0%，分別有30份和34份資源EGCG含量在這一范圍。ECG含量分布較為集中，有63份資源ECG含量為1.5%～3.0%。兒茶素單體構(gòu)成及含量顯著影響茶葉品質(zhì)，酯型兒茶素抗氧化性強(qiáng)但滋味苦澀，非酯型兒茶素澀味較強(qiáng)，回味稍甜[31]，茶葉中的EGC、C和EC共同組成茶樹中的非酯型兒茶素，EGCG、GCG和ECG組成茶樹中的酯型兒茶素，由圖1-I～1-J可知，非酯型兒茶素含量主要分布為1.5%～2.5%，酯型兒茶素主要分布為8.0%～10.0%，分別有46份和30份。

2.2.2 兒茶素指數(shù)CI分布分析 茶樹種質(zhì)兒茶素指數(shù)CI的高低與其紅茶適制性直接相關(guān)[32]，由圖2可知，115份貴州茶樹種質(zhì)中除4份因EGC和EGCG均為0，無法求出CI外，其余111份種質(zhì)兒茶素指數(shù)范圍為0.20～31.8，平均值為3.26，大部分種質(zhì)(82份)CI值小于1.0。劉玉飛等[13]研究認(rèn)為，CI指數(shù)大于1.0為高CI茶樹種質(zhì)，本次研究中有29份種質(zhì)CI值大于1.0，其中更有13份種質(zhì)CI大于10，這表明貴州茶樹種質(zhì)中高CI資源豐富，后續(xù)有望從中選育出高CI、高茶黃素茶樹良種。

2.3 聚類分析

基于8個多酚類物質(zhì)指標(biāo)，115份茶樹資源可被分為4個類群(圖3,表4)，第Ⅰ類包括GT80-GT95，為來自三都的16份野生茶樹資源，茶多酚含量極顯著高于其他3類，C為主要兒茶素組分，且含量極顯著高于其他3類；第Ⅱ類有14份，全部來自普安，ECG為主要兒茶素組分，其次是EC、ECG和EC含量極顯著高于其他3類；第Ⅲ類和第Ⅳ類包括6份普安資源和湄潭、黎平、望謨等地資源GT-1-GT-79共85份，兒茶素組成上既有共同點(diǎn)也有不同之處，共同點(diǎn)在于，EGCG是這兩類的主要兒茶素組分，含量其次的兒茶素組分為ECG和EGC，不同之處在于第Ⅲ類的茶多酚，EGCG和ECG含量極顯著高于第Ⅳ類。

表4 4個類群茶多酚和兒茶素類含量比較

2.4 優(yōu)異資源鑒選

《NY/T2013-2011農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評價規(guī)范 茶樹》[33]中規(guī)定茶多酚含量≥25.0%為高茶多酚特異資源，115份資源中‘SD-4’茶多酚含量在27.49%，為特異高茶多酚茶樹資源。

EGCG是兒茶素中的核心組分，也是茶葉重要功能成分，具備抗病毒[34]、抗糖尿病[35]等諸多生理功能，茶樹是EGCG的天然重要來源，高EGCG茶樹品種的選育也是近年來茶樹功能育種的熱點(diǎn)，一般將EGCG含量≥10.0%定義為高EGCG茶樹種質(zhì)[36-39]。由表5可知，115份貴州茶樹資源中6份資源EGCG含量≥10.0%，可作為高EGCG特異茶樹種質(zhì)重點(diǎn)開發(fā)利用。GCG和ECG是酯型兒茶素的一部分，具備一定的生理功能，GCG是EGCG的表型異構(gòu)體[40]，在熱的作用下EGCG極易轉(zhuǎn)變成GCG[26]，GCG在抑制膽固醇吸收方面表現(xiàn)出來的生理活性要強(qiáng)于EGCG[41]，且結(jié)構(gòu)相對更穩(wěn)定，115份貴州茶樹資源中，LP057GCG含量高達(dá)4.00%，為特異高GCG茶樹種質(zhì)。ECG是茶樹中另一含量豐富的酯型兒茶素，對癌細(xì)胞的抗增殖作用強(qiáng)于EGCG[42]，115份貴州資源中ECG含量差異較大，其中有7份ECG含量在8.0%以上，可作為高ECG茶樹種質(zhì)加以開發(fā)利用。

表5 優(yōu)異生化成分含量茶樹資源

茶黃素是影響紅茶湯色亮度、滋味強(qiáng)度和鮮爽度的重要物質(zhì)，成品茶中茶黃素含量越高，紅茶品質(zhì)越好[2]，兒茶素指數(shù)(CI)是判斷茶樹種質(zhì)是否適制紅茶的重要指標(biāo)，較高的兒茶素指數(shù)(CI)可有效促進(jìn)紅茶中茶黃素的形成[13,32]，其中‘銅沿1095’‘SD-2’‘PA02’等13份種質(zhì)CI值大于10，可作為高CI適制紅茶優(yōu)質(zhì)種質(zhì)加以開發(fā)利用。

3 討 論

茶樹中的茶多酚類物質(zhì)包括兒茶素(黃烷醇類)；黃酮、黃酮醇類；花青素、花白素類；酚酸及縮酚酸等[2]。兒茶素類化合物(Catechins)是構(gòu)成茶葉多酚類物質(zhì)的主體，約占茶多酚含量的70.0%～80.0%[26]，雷波野生茶樹[43]、大瑤山野生茶樹[44]、云南大葉種[45]、鉛山群體種[46]等茶樹資源中兒茶素占比大多在這一范圍內(nèi)，本研究共分析了來自8個縣市的115份茶樹資源，大部分兒茶素占比為60.0%～80.0%，符合兒茶素占比的常規(guī)規(guī)律，而三都資源較為特殊，16份三都資源茶多酚平均值為23.0%，兒茶素總量平均為 6.3%，兒茶素總量僅占茶多酚含量的四分之一，三都資源高茶多酚低兒茶素的表現(xiàn)，可能是因?yàn)槿假Y源中存在著未知的多酚類物質(zhì)，后續(xù)可結(jié)合制備液相、高速逆流色譜、質(zhì)譜、核磁共振等手段對未知組分進(jìn)行分離和化合物鑒定，明確三都資源中未知的多酚類物質(zhì)。

貴州地處茶樹起源中心地帶，蘊(yùn)藏著豐富的多樣的茶組植物，對于茶樹起源演化研究必不可少。栽培種茶樹以EGCG為主要兒茶素組分，其EGCG占比可達(dá)兒茶素總量的76%[26]，而原始的茶組植物中以C、EC為代表的簡單兒茶素含量更高[47]。聚類分析顯示，115份貴州茶樹種質(zhì)可明顯分為4類，第Ⅰ類在兒茶素組成上與廣西青山野生茶樹資源[48]、元寶山茶飲植物和榕江茶一致[49]，均以C為主要兒茶素組分。第Ⅱ類以ECG為主要兒茶素單體，這與云南的安定野茶[50]、石佛山柳葉青[51]等野生茶樹資源兒茶素組成相一致，且這兩類茶兒茶素組成與禿房茶C.gymnogynaChang[52]、可可茶[53]等茶樹種質(zhì)資源同樣差異明顯，后續(xù)可通過表型鑒定結(jié)合分子手段開展這兩類茶的分類研究。

4 結(jié) 論

研究的115份貴州茶樹種質(zhì)多酚類物質(zhì)平均變異系數(shù)為69.79%，平均遺傳多樣性指數(shù)為 1.665，具豐富的遺傳多樣性，對茶樹種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳改良及新品種選育具有重要意義。同時篩選出1份高茶多酚(≥25.0%)種質(zhì)，1份高GCG(≥4.0%)種質(zhì)，6份高EGCG(≥10.0%)種質(zhì)，7份高ECG(≥8.0%)種質(zhì)，13份高CI(≥10)種質(zhì)，可為后續(xù)貴州茶產(chǎn)業(yè)特色化及差異化發(fā)展提供種質(zhì)基礎(chǔ)。