甘肅省4種蘋果病毒檢測及其分子多樣性分析

郗 征，李世帆，王 輝，李恩琛，邵 欣，陳雅寒，徐秉良

(1.甘肅農業(yè)大學 植物保護學院，蘭州 730070；2.甘肅臨夏州森林病蟲害防治檢疫站,甘肅臨夏 731100)

蘋果(MaluspumilaMill.)為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉喬木[1]，果實具有營養(yǎng)價值高、耐貯性好和供應周期長的特點[2]，在全世界范圍內廣泛栽培[3]。據(jù)聯(lián)合國糧農組織(http://www.fao.org/faostat/zh/#data)和國家統(tǒng)計局(https://data.stats.gov.cn/easyquery.htm?cn=C01)數(shù)據(jù)計算，2019年中國蘋果總栽培面積和產量分別占世界總量的41.9%和 48.6%，均居世界第一。目前黃土高原產區(qū)為中國最大蘋果生產區(qū)[4]，甘肅省是該區(qū)第二大生產省份，2016年年產量達360.13萬t，居全國第5位[5]。

蘋果病毒病目前在中國的蘋果產區(qū)均有發(fā)生[6]，其中在甘肅省部分蘋果主產區(qū)發(fā)生率較高[7-10]。蘋果樹受病毒侵染后，可導致樹勢衰弱，葉片縮小、褪綠葉斑，果實銹斑、花臉或畸形等，造成果實品質和產量下降[11-14]。病原主要由帶毒接穗、砧木通過嫁接傳播[12]，通過苗木和接穗的調運遠距離傳播[15]。果樹感病后終生帶毒[16]，目前尚無有效的治療藥劑，培育無毒苗木是目前國內防治蘋果病毒病的有效手段。隨著蘋果“矮砧密植”栽培方式的推廣，經由帶毒接穗傳播病毒并危害蘋果生產的風險愈發(fā)嚴峻[15]。因此，盡早明確各蘋果產區(qū)病毒發(fā)生情況和病毒的基因信息將為病毒病的防治奠定基礎。中國已經明確鑒定的蘋果病毒約有20種[13,17-19]，根據(jù)病毒侵染后是否在栽培品種上表現(xiàn)癥狀可將病原分為非潛隱性病毒和潛隱性病毒[20]，主要發(fā)生的有：蘋果壞死花葉病毒(Apple necrosis mosaic virus，ApNMV)[21]和蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)[22]2種非潛隱性病毒；蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)[23-24]、蘋果莖溝病毒(Applestem grooving virus，ASGV)[24-25]、蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)3種潛隱性病毒[10,24]。李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV)在中國主要危害櫻桃、桃等薔薇科李屬(Prunus)植物[26]，該病毒侵染蘋果，可能為引起蘋果花葉病毒的病原[27-28]。雖然2011-2017年甘肅省蘋果產區(qū)已經開展過ApNMV、ASGV、ASPV、和ACLSV等病毒發(fā)生情況的研究[7-10,21]，但是近5年隨該省蘋果種植面積不斷擴大和新品種的引進，蘋果病毒病種類、發(fā)生及分子變異情況尚不明確。

本研究對甘肅省隴南、天水、平涼、蘭州和白銀5市蘋果產區(qū)采集的93份葉片樣品進行RT-PCR鑒定，以了解甘肅省蘋果產區(qū)內ASGV、ASSVd、ACLSV和PNRSV病毒發(fā)生狀況；對優(yōu)勢種ASGV的cp基因片段進行序列分析，明確甘肅省蘋果主產區(qū)內ASGV分類地位和分子變異情況，以期為蘋果病毒病的科學防控策略提供有效信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年5月至10月，分別在甘肅省蘋果產區(qū)果園內隨機采集蘋果葉片，樣品信息如下：隴南市禮縣曾家村(5份‘富士’)，天水市秦州區(qū)天水鎮(zhèn)(9份‘富士’)、秦安縣葉堡鄉(xiāng)(3個果園共33份‘富士’)，平涼市靜寧縣德美示范基地(10份‘蜜脆’)、靜寧縣李溝村(7份‘富士’)，蘭州市西固區(qū)馬家山村(3份‘富士’，21份‘花?！?，白銀市靖遠縣(5份‘富士’)，共計93個樣品。葉片用自封袋密封放入裝有干冰的泡沫箱內帶回實驗室，經液氮研磨至2 mL無酶離心管內，放入-80 ℃冰箱內保存。

1.2 樣品RT-PCR鑒定

反轉錄反應：使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)，以1 μg植物總RNA為模板，反應體系為Oligo(dT)Primer(50 μmol/L)1 μL、5× PrimeScript Buffer 4 μL、PrimeScript RT EnzymeMixⅠ 1 μL、Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL、Total RNA 1 μL、RNase Free dH2O 12 μL。混勻后，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，產物用10 μL ddH2O稀釋，-20 ℃保存，備用。

PCR擴增鑒定：檢測引物均參考已發(fā)表引物(表1)，由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。反應體系為模板cDNA 2.0 μL、Forward Primer(10 μmol/L)1.0 μL、Reverse Primer(10 μmol/L)1.0 μL、TaqMix 12 μL、ddH2O補至25 μL。PCR擴增程序為94 ℃ 預變性3 min，94 ℃變性30 s，對應引物退火溫度退火30 s，72 ℃延伸至對應擴增片段時間，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。反應結束后取5 μL產物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(預先加入0.01%綠色熒光核酸染液，Solarbio)。

表1 蘋果病毒病RT-PCR檢測引物

1.3 ASGVcp片段擴增、克隆及測序

采用上述步驟提取蘋果葉片總RNA和進行反轉錄，利用引物對ASGV-F/R，擴增ASGVcp基因片段。反應體系為cDNA 2 μL、Forward Primer(10 μmol/L)1 μL、Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL、TaqMix 12 μL、ddH2O補至25 μL。PCR擴增程序為94 ℃ 預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。反應結束后取5 μL產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收[天根生化科技(北京)有限公司]的產物，與pMD19-T Vector(TaKaRa)連接，轉化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞[天根生化科技(北京)有限公司]，涂布在LB 固體培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp)上，37 ℃培養(yǎng)過夜，將PCR鑒定為陽性的菌液送往西安擎科澤西生物科技有限責任公司測序，3次重復。

1.4 ASGV cp序列分析

采用Vector NTI Advance 11軟件對測序結果進行校正拼接，將得到的ASGVcp基因片段與GenBank登錄的34個來源不同的ASGV分離物基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以櫻桃病毒A(Cherry virus A，CVA)cp基因序列(登錄號：NC_003689.1)作為外群。利用MEGA X軟件中的CLUSTAL W算法比對序列，用鄰接法(Neighbour-joining，NJ)構建系統(tǒng)進化樹，自展值設置為1 000。系統(tǒng)進化樹顯示閾值為50%。

2 結果與分析

2.1 甘肅省蘋果病毒發(fā)生分析

2.1.1 蘋果病毒在不同產區(qū)和栽培品種上的發(fā)生情況 在甘肅隴南、天水、平涼、蘭州和白銀市蘋果產區(qū)果園內隨機取樣93份樣品，通過RT-PCR技術對采集到的蘋果葉片進行檢測發(fā)現(xiàn)(表2)，ASGV檢出率最高，在全部采集果園內均有發(fā)生，平均檢出率達到87.1%，其中有6個果園的檢出率達100%，ASGV成為危害甘肅省蘋果生產的主要病毒。ASSVd、ACLSV和PNRSV在甘肅省均有發(fā)生，平均檢出率分別為41.9%、10.7%和11.8%。天水市4種蘋果病毒檢出率較高，在所調查的兩地4種病毒均有檢出；在平涼靜寧縣德美示范基地的蘋果園中ASSVd檢出率達90.0%，遠高于其他調查果園。病毒病發(fā)生情況調查發(fā)現(xiàn)，所有93份樣品中(48份‘富士’，26份‘花牛’，10份‘蜜脆’和9份‘元帥’)，不同品種的各病毒檢出率差異不明顯，ASGV在各個栽培品種中均為優(yōu)勢種(圖1)。

表2 甘肅省各地區(qū)蘋果病毒病發(fā)生率

2.1.2 甘肅省蘋果病毒復合侵染情況 在所調查的93份蘋果葉片樣品中，ASGV單一侵染的有34份，檢出率為36.6%。靜寧縣李溝村只檢測到ASGV，其余所調查的果園均發(fā)生不同程度復合侵染。所有檢測樣品中共7種復合侵染類型?！癆SGV+ASSVd”為主要復合侵染類型(表3)，檢出率達37.6%，其余2種病毒復合侵染類型和檢出率分別為：“ASGV+PNRSV”，4.3%；“ASGV+ACLSV”，3.2%；“ASSVd+ACLSV”，2.2%。3種病毒復合侵染：“ASGV+ASSVd+ACLSV”，4.3%；“ASGV+ASSVd+PNRSV”，4.3%。4種病毒復合侵染：“ASGV+ASSVd+ACLSV+PNRSV”，3.2%。天水、蘭州和白銀市復合侵染發(fā)生情況最為嚴重，每個調查地至少發(fā)生3種病毒的復合侵染(圖1)。

表3 蘋果病毒單一或復合侵染類型和檢出率

2.2 ASGV cp序列系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對測序片段進行拼接校正，共得到4個ASGV cp片段序列：A29(富士，天水市秦州區(qū)天水鎮(zhèn))、A39(富士，天水市秦安葉堡鄉(xiāng))、A42(富士，天水市秦安縣葉堡鄉(xiāng))和A80(花牛，蘭州市馬家山村)，利用NCBI在線工具BLASTn進行多序列比對，將4個序列與GenBank登錄的34個ASGV分離物基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以櫻桃病毒A的cp基因序列作為外群。通過分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)(圖2)，38個ASGV分離物cp基因序列被聚為3個組，組Ⅰ內包含35個分離物，被進一步分為2個亞組，亞組Ⅰ-Ⅰ包含A29、A39、A42和A80在內的22個分離物，其中A29與來自中國云南蘋果的ML-1分離物遺傳距離最近，共聚為同一支，cp基因核酸序列同源性為99.2%，A39與A42聚為一支，兩者與來自中國陜西蘋果的YL06分離物核酸序列同源性為97.1%和96.9%，A80單獨成一簇并與A39、A42、YL06、CO-kr1、GW-JS和TJX-1聚在同一支；亞組Ⅰ-Ⅱ包含13個分離物。組Ⅱ僅有一支來自中國河南的梨分離物P-L2。組Ⅲ內包含來自印度的梨分離物pear in India和獼猴桃分離物Ki-1。

3 討 論

本研究調查發(fā)現(xiàn)：ASGV檢出率為87.1%，在甘肅省蘋果產區(qū)普遍發(fā)生；ASSVd、ACLSV和PNRSV在甘肅省均有發(fā)生，檢出率分別為 41.9%、10.7%和11.8%；甘肅省蘋果病毒以“ASGV+ASSVd”為主要復合侵染類型，檢出率為36.6%。冀志蕊[10]在2011年對蘭州、平涼(涇川縣)的20份蘋果幼嫩枝條檢測發(fā)現(xiàn)，ASPV和ACLSV平均檢出率分別為75.0%和60.0%，蘭州ASGV檢出率達80%；張明珍[9]在2013年對蘭州蘋果種植園8個蘋果冬芽樣品檢測發(fā)現(xiàn)，ACLSV、ASGV和ASPV的帶毒率分別為 87.5%、62.5%和50%，3種病毒的復合侵染率達37.5%；李幗英等[8]在2012-2014年調查發(fā)現(xiàn)，天水蘋果主產區(qū)36個果園中ACLSV和AGSV陽性率較高，分別為61.1%和58.3%，樣品平均帶毒率為83.3%。前人調查結論與本研究相似，目前，甘肅省各蘋果產區(qū)ASGV、ASSVd、ACLSV和PNRSV 4種病毒病發(fā)生普遍，復合侵染類型多樣化，蘭州和天水市蘋果病毒危害最為嚴重，ASGV逐漸成為危害甘肅省蘋果生產的主要病毒。由于蘋果“矮砧密植”栽培方式的推廣，并且ASGV的潛隱性危害特性使得癥狀識別變得困難，可能使大量帶毒接穗嫁接到健康砧木而造成廣泛而嚴重的危害，應當引起重視。

4個源自甘肅蘋果ASGV分離物cp基因與GenBank所登錄的來源不同的34個分離物的系統(tǒng)進化分析表明，在基于38個ASGV分離物的cp基因序列所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，分離物A29、A39、A42和A80均聚在同一亞組Ⅰ-Ⅰ內，甘肅4個分離物都與來自中國陜西、云南蘋果的分離物有較高的核酸序列同源性，亞組Ⅰ-Ⅰ內的22個分離物中有16個來自蘋果，說明ASGV的cp基因變異可能具有寄主相關性，但在亞組Ⅰ-Ⅱ內寄主相關并不明顯；全部38個分離物分屬6個國家的不同地區(qū)，中國蘋果分離物均來自本國蘋果主產區(qū)，系統(tǒng)發(fā)育分析和cp基因核酸序列同源性均無法分辨出分離物的地理來源規(guī)律。

目前，對ASGV分離物分子變異的寄主相關性和地理關聯(lián)性上的研究結果分歧較大，姬盼等[32]認為，ASGV分子變異存在寄主和地理關聯(lián)；而李正男等[33]、Hu等[34]的分析發(fā)現(xiàn)，ASGV不同分離物并無寄主專一性與地理分布規(guī)律。Liebenberg等[35]和張雪嬌等[36]研究發(fā)現(xiàn)，ASGV遺傳進化具有寄主相關性而無地理關聯(lián)；Kim等[37]發(fā)現(xiàn)來自蘋果與梨的ASGV分離物的cp基因序列在核苷酸和氨基酸水平上具有與宿主相對應的系統(tǒng)發(fā)育差異。分析樣本較少可能是導致結論不同的原因之一，并且由于果樹特殊的栽培方式而導致經帶毒接穗、嫁接傳毒和與帶毒砧木病毒間基因重組的發(fā)生，使得不同地域和寄主間病毒交流廣泛，造成對ASGV不同寄主和地域分離物相關性判定的誤差。GenBank中所登錄的ASGV分離物的序列信息主要來自中國，其次來自印度、韓國和日本等國，且在中國境內所登錄的蘋果分離物主要來自于陜西和山東等省，尚缺乏中國蘋果四大主產區(qū)廣泛的序列信息，這使得對ASGV的分子變異分析變得困難。本研究明確了ASGV甘肅蘋果分離物的分類地位，是對中國ASGV發(fā)生情況和群體多樣性的有力補充。