蘭州大尾羊脂聯(lián)素及其受體基因全長cDNA克隆與表達(dá)模式分析

張德榮，孫渭博，曹 忻，李羽翡，柏家林

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，蘭州 730030；4.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，蘭州 730070)

脂聯(lián)素(adiponectin, APN)，也稱脂肪連接蛋白，是由脂肪細(xì)胞分泌的一種具有生物活性的內(nèi)源性多肽或蛋白質(zhì)(一種具有保護(hù)作用的脂肪因子)，由N端信號(hào)肽、變異區(qū)域、N-膠原蛋白三螺旋區(qū)和C端球狀區(qū)4 個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[1]。脂聯(lián)素由APN基因編碼，該基因最早定位在人類染色體的3q27，全長17 kb，在哺乳動(dòng)物中高度保守，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼247個(gè)氨基酸(外顯子1不參與編碼蛋白)，編碼的APN蛋白分子質(zhì)量約為30 ku[2-3]。脂聯(lián)素前體經(jīng)加工修飾可形成低分子質(zhì)量(low-molecular-weight, LMW)蛋白與高分子質(zhì)量(hight-molecular-weight, HMW)蛋白，兩者在機(jī)體內(nèi)具有獨(dú)特的生物學(xué)功能[4-5]。作為一種脂肪細(xì)胞因子，脂聯(lián)素必須與靶器官上的特異性受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)功能，Yamauchi等[6]研究表明脂聯(lián)素存在脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(adiponectin receptor 2,AdipoR2)兩種亞型受體。AdipoRs含有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)和功能上完全不同于G蛋白偶聯(lián)受體，AdipoR1基因主要在骨骼肌組織中表達(dá)，對(duì)脂聯(lián)素球狀區(qū)有高度親和力；AdipoR2基因主要在脂肪和肝臟組織中表達(dá)，對(duì)全長、球形脂聯(lián)素有中度親和力，APN基因通過與AdipoRs結(jié)合直接參與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase, AMPK)和過氧化物酶體增殖物激活受體-α(Peroxisome Proliferators-activated Receptor α, PPAR-α)途徑，間接調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、葡萄糖利用和糖異生等代謝及胰島素的分泌[7-8]。APN基因的研究主要集中在人及嚙齒動(dòng)物，如人類肥胖、脂質(zhì)代謝及胰島素耐受等。在家畜動(dòng)物中，陳星伊等[9]研究發(fā)現(xiàn)AdipoR1和AdipoR2基因參與秦川牛肌肉生長發(fā)育的調(diào)控；孟憲然等[10]在研究內(nèi)蒙古絨山羊時(shí)發(fā)現(xiàn)APN基因是影響肉品質(zhì)的重要候選基因；An等[11]研究表明APN基因影響綿羊早期生長速度、瘦肉量及胴體脂肪沉積深度等。此外，人們最初認(rèn)為成熟的脂肪細(xì)胞是脂聯(lián)素蛋白合成和分泌的唯一場所，但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，其在多種哺乳動(dòng)物的心肌、垂體、成骨細(xì)胞、卵巢等組織中均有不同程度的表達(dá)[12]。因此，本研究以蘭州大尾羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象，同源克隆和RACE克隆APN、AdipoR1和AdipoR2基因的全長cDNA序列，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析脂聯(lián)素及其受體基因在15種組織中的表達(dá)規(guī)律，為下一步開展綿羊脂聯(lián)素及其受體在多克隆抗體制備及免疫組化等方面機(jī)制機(jī)理的研究打下基礎(chǔ)，為后期開展的相關(guān)研究提供必要的理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇3只健康且體況良好的6月齡蘭州大尾羊(甘肅省永靖縣瑞霖科技養(yǎng)殖有限公司)，經(jīng)頸靜脈放血處死后，無菌條件下采集15種組織：背最長肌、肩部皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肝臟、腎臟、心臟、肺、脾、卵巢、睪丸、大腸、小腸、間腦、瘤胃和皺胃，將組織分割為1 cm3的小塊，裝入標(biāo)記好的凍存管置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱保存。

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

采用Takara RNAiso Plus總RNA 提取試劑盒分別提取15種組織總RNA，產(chǎn)物溶于DEPC水，-80 ℃保存，備用。采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification試劑盒對(duì)背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，產(chǎn)物-20 ℃保存，備用。采用All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒分別將15種組織中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，產(chǎn)物于-20 ℃保存，備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

1.3.1 簡并引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)人、鼠、大鼠、牛、山羊、雞和豬的脂聯(lián)素及其受體基因序列同源性比較結(jié)果，運(yùn)用PrimerPrimer 5.0 軟件設(shè)計(jì)其同源克隆的上下游引物，具體序列及產(chǎn)物大小見表1，引物由生工生物工程有限公司合成。

表1 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因同源克隆引物序列

1.3.2 RACE引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)綿羊脂聯(lián)素及其受體同源克隆基因片段測序結(jié)果，運(yùn)用PrimerPrimer 5.0軟件設(shè)計(jì)其5′-RACE 特異性引物(Gene Specific Primer, GSP)和3′-RACE特異性引物。再依據(jù)綿羊脂聯(lián)素及其受體RACE克隆測序結(jié)果，拼接全長cDNA序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的驗(yàn)證PCR引物，具體引物序列及產(chǎn)物大小見表2，引物由生工生物工程有限公司合成。

表2 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因RACE特異引物及驗(yàn)證PCR引物

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)RACE克隆出的APN、AdipoR1和AdipoR2基因全長cDNA 序列，運(yùn)用PrimerPrimer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以綿羊3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參基因(NM_001190390)，具體序列及產(chǎn)物大小見表3，引物由生工生物工程有限公司合成。

表3 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因組織特異性qPCR引物

1.4 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因克隆

1.4.1 同源克隆 分別取背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織cDNA 第一鏈稀釋液2.0 μL，脂聯(lián)素及其受體基因上、下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，TakaRaTaqDNA聚合酶1.5 μL，加雙蒸水至25 μL。運(yùn)用Touchdown PCR技術(shù)，分別擴(kuò)增APN、AdipoR1和AdipoR2基因同源片段，具體反應(yīng)條件見表4。PCR產(chǎn)物運(yùn)用1 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表4 綿羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因同源片段擴(kuò)增條件

1.4.2 RACE克隆 分別以背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織總RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，RACE克隆APN、AdipoR1和AdipoR2基因。RACE克隆反應(yīng)體系(50 μL)為cDNA模板2.5 μL，10×UPM 5 μL，5′-RACE GSP1 1 μL，3′-RACE GSP1 1 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 1 μL，50×Advantage 2 Ploymerase Mix 1 μL和PCR-Grade Water 33.5 μL。APN基因5′-RACE和3′-RACE反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25個(gè)循環(huán)。AdipoR1基因5′-RACE反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25 cycles；3′-RACE反應(yīng)采用Touchdown PCR技術(shù)，反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個(gè)循環(huán)，94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25 個(gè)循環(huán)。AdipoR2基因5′-RACE反應(yīng)采用Touchdown PCR 技術(shù)，反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個(gè)循環(huán)，94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25個(gè)循環(huán)；3′RACE 反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用TakaRa MinREST Gel DNA Extraction Kit(Ver.3.0)進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物回收，并構(gòu)建克隆載體測序。

1.4.3 PCR驗(yàn)證 分別以背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織總RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，PCR擴(kuò)增APN、AdipoR1和AdipoR2基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)為cDNA模板1 μL，驗(yàn)證上游引物1 μL，驗(yàn)證下游引物1 μL，dNTP Mix 1 μL，TaKaRa LATaq0.5 μL，10×Buffer 2 μL和PCR-Grade Water 13.5 μL。APN基因PCR反應(yīng)條件為 95 ℃、2 min；98 ℃、2 min，57 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。AdipoR1和AdipoR2基因PCR反應(yīng)條件為95 ℃、2 min；98 ℃、2 min，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用0.9 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用TakaRa MinREST Gel DNA Extraction Kit(Ver.3.0)進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物回收，并構(gòu)建克隆載體測序。

1.4.4 克隆載體構(gòu)建及測序 選用 TakaRa DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將脂聯(lián)素及其受體基因同源克隆、5′-RACE、3′-RACE、驗(yàn)證 PCR的片段回收并與克隆載體T-V ector pMDTM19 Simple連接，過夜后熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cell JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，送至生工生物工程有限公司使用通用引物進(jìn)行測序。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

分別以15種組織反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA鏈為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL、上下游引物各 0.2 μL、2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL和DEPC H2O建立25 μL qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94 ℃、2 min，94 ℃、5 s，57 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。在LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中測定APN、AdipoR1和AdipoR2在15種組織中的表達(dá)水平，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。

1.6 生物信息學(xué)分析

從NCBI上分別下載人、鼠、大鼠、牛、山羊、雞和豬等物種對(duì)應(yīng)APN、AdipoR1和AdipoR2基因序列，利用MEGA軟件進(jìn)行同源性分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有基因在每個(gè)樣品(組織)重復(fù)進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，不同組織的脂聯(lián)素及其受體基因在其不同濃度下表達(dá)量的影響均采用單因子方差分析對(duì)其顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊ANP基因同源克隆、RACE擴(kuò)增及序列分析

以背最長肌的反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈稀釋液為模板，同源克隆出310 bp的ANP基因片段(圖1-A)，再利用RACE技術(shù)，克隆出大小為950 bp的5′-RACE片段(圖1-B)和1 500 bp的3′-RACE片段(圖1-C)，拼接獲得全長為2 101 bp的ANP基因cDNA(GenBank登錄號(hào)：KJ1592123，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ159213.1)，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增出大小為1 193 bp的ANP基因片段(圖1-D)。通過MEGA分析顯示，綿羊APN蛋白序列與山羊和牛的相似性較高(圖2)。

2.2 綿羊 AdipoR1基因同源克隆、RACE擴(kuò)增及序列分析

以肩部皮下脂肪的反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈稀釋液為模板，同源克隆出364 bp的AdipoR1基因片段(圖3-A)，再利用RACE技術(shù)，克隆出大小為500 bp的5′-RACE片段(圖3-B)和大小為1 600 bp的3′-RACE片段(圖3-C)，拼接獲得全長為2 035 bp的AdipoR1基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：KJ159212，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ159212.1)，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增出大小為1 100 bp的AdipoR1基因片段(圖3-D)。通過MEGA分析顯示，綿羊AdipoR1蛋白序列與山羊、牛、人、小鼠、大鼠和豬的相似性較高，而與雞的相似性最低(圖4)。

2.3 綿羊 AdipoR2基因同源克隆、RACE擴(kuò)增及序列分析

以肝臟組織的反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈稀釋液為模板，同源克隆出綿羊AdipoR2基因大小為550 bp的同源片段(圖5-A)；再利用RACE技術(shù)克隆出大小為1 100 bp的5′-RACE片段(圖5-B)和700 bp的3′-RACE片段(圖5-C)，拼接獲得全長為1 809 bp的綿羊AdipoR2基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào)為：KF921623，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF921623.1)，驗(yàn)證 PCR 擴(kuò)增出約1 100 bp的AdipoR2基因片段(圖5-D)。通過MEGA分析顯示，綿羊AdipoR2蛋白序列與山羊、牛、小鼠、大鼠、雞和豬的相似性較高，而與人的相似性最低(圖6)。

2.4 綿羊APN基因在15種組織中的相對(duì)表 達(dá)量

通過實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測綿羊ANP基因在15種組織樣品中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，蘭州大尾羊APN基因在15種組織中均有表達(dá)。其中，在背最長肌中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是在心臟和瘤胃組織；在其他組織中相對(duì)表達(dá)量較低，差異不顯著，在肩部皮下脂肪中的相對(duì)表達(dá)量最低。

2.5 綿羊 AdipoR1基因在15種組織中的相對(duì)表達(dá)量

通過實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測綿羊AdipoR1基因在15種組織樣品中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖8。結(jié)果表明蘭州大尾羊AdipoR1基因在15種組織中均有表達(dá)。其中，在內(nèi)臟脂肪和肩部皮下脂肪中的相對(duì)表達(dá)量最高，兩者間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他組織(P<0.05)；其次是脾臟、心臟、小腸、大腸、肝臟、肌肉和皺胃組織；在其他組織中相對(duì)表達(dá)量較低，差異不顯著，在間腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最低。

2.6 綿羊 AdipoR2基因在15種組織中的相對(duì)表達(dá)量

通過實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測綿羊AdipoR2基因在15種組織樣品中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明蘭州大尾羊AdipoR2基因在15種組織中均有表達(dá)。其中，在內(nèi)臟脂肪中的表達(dá)量最高，其次是肩部皮下脂肪，與肝臟、心臟、脾臟、大腸、小腸、皺胃等其他組織中表達(dá)量相比，差異極顯著(P<0.01)，而在卵巢、睪丸、肺、腎臟、間腦、瘤胃中幾乎不表達(dá)。

3 討 論

研究表明APN基因經(jīng)磷酸絡(luò)氨酸銜接蛋白(phosphotyrosine interactingwith PH domain and leucine zipper 1, APPL1)作用后，可與脂聯(lián)素受體特異性結(jié)合，激活A(yù)MPK、PPARα和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路進(jìn)行下游糖類和脂肪代謝調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮生物學(xué)功效[13-14]。APN基因在抗氧化[15]、抗消炎[16]、抗動(dòng)脈粥硬化[17]、II型糖尿病[18]和胰島素拮抗[19]以及心血管疾病[20]等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)水平的變化直接影響游離脂肪酸和抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)合成[21]，導(dǎo)致肥胖、心血管疾病和II型糖尿病等代謝綜合癥的發(fā)生[22]，說明該基因?qū)θ伺c畜禽的脂類代謝及相關(guān)疾病有著重要的影響。但綿羊APN基因的相關(guān)研究報(bào)道較少，而被譽(yù)為“長尾脂型”典型代表的蘭州大尾羊[23]是研究肥胖、糖尿病等代謝疾病的最好載體，對(duì)其進(jìn)行生脂機(jī)理調(diào)控研究和改善肉質(zhì)水平有重要的參考價(jià)值。

本研究采集蘭州大尾羊背最長肌、肩部皮下脂肪和肝臟組織，同源克隆出綿羊APN、AdipoR1及AdipoR2基因cDNA，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用RACE技術(shù)克隆綿羊APN、AdipoR1及AdipoR2基因5′-UTR和3′-UTR區(qū)域，隨后分別進(jìn)行拼接得到2 101 bp、2 035 bp和1 809 bp的全長APN、AdipoR1及AdipoR2基因，并利用PCR驗(yàn)證完整性。

最初人們認(rèn)為脂聯(lián)素只在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，但后來的研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素在其他非脂肪細(xì)胞中也能表達(dá)。在人肝細(xì)胞、小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞、體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞、豬胎盤和子宮、結(jié)腸黏液細(xì)胞、唾液腺上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞等中均檢測到脂聯(lián)素的表達(dá)[24]。Ding等[25]通過克隆豬的APN基因并測定APN及其受體基因在不同組織中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，APN基因和AdipoR2基因在皮下脂肪組織中大量表達(dá)，AdipoR2基因在肝臟、心臟、骨骼肌和脾臟組織中少量表達(dá)；AdipoR1基因在心臟和骨骼肌中大量表達(dá)，在脂肪、肝臟和脾臟組織中少量表達(dá)。Smolinska等[26]研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可通過影響豬發(fā)情周期中的子宮情況來調(diào)控豬的繁殖，并且發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素及其受體基因和蛋白在豬妊娠早期的子宮、孕體和滋養(yǎng)層中均有表達(dá)，且在妊娠的不同時(shí)期表達(dá)量存在差異。張賽賽[27]研究發(fā)現(xiàn)，APN基因在小尾寒羊和杜泊羊中呈現(xiàn)出組織表達(dá)特異性，不同組織間，APN基因在皮下脂肪、腎周脂肪、腹股溝脂肪、臂二頭肌、心血管組織中有表達(dá)，在肝臟、腎臟、卵巢組織中未檢測到表達(dá)，提示APN基因的表達(dá)有一定的組織特異性，而且脂肪組織中的表達(dá)水平極顯著高于其他組織，但在脂肪組織間無差異。李雪梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素基因在藏山羊的脂肪組織中高表達(dá)，而在肌肉組織和胃中表達(dá)量較低，在心臟、肝臟和脾臟等組織中未檢測到。本研究發(fā)現(xiàn)APN基因在肌肉、心臟和皺胃組織中高表達(dá)，在其余組織中少量表達(dá)；AdipoR1基因在內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪、脾臟、心臟、小腸、大腸、肝臟、皺胃和肌肉組織中高表達(dá)，在其余組織中少量表達(dá)；AdipoR2基因在內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪組織中高表達(dá)，在其余組織中表達(dá)量很低，幾乎不表達(dá)。研究結(jié)果表明脂聯(lián)素及其受體基因雖然在不同的組織中均存在一定程度的表達(dá)，盡管在同源性較高的物種間，其表達(dá)也存在明顯的區(qū)別，這應(yīng)與各物種的起源、衍變過程及生存環(huán)境等息息相關(guān)。APN基因在肌肉組織中高表達(dá)表明其可能參與肌肉中糖脂代謝及胰島素敏感性調(diào)節(jié)等。AdipoR1和AdipoR2基因在脂肪組織中高表達(dá)，說明兩者在脂肪組織中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，可能參與脂肪細(xì)胞的分化、葡萄糖及脂肪酸的代謝等[28-29]，此外，在大腸、小腸、瘤胃及皺胃組織中均檢測到APN和AdipoR1基因的表達(dá)，推斷其在蘭州大尾羊的消化吸收過程中存在特殊作用，但相關(guān)研究較少，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究通過同源克隆及RACE克隆技術(shù)得到綿羊ANP、AdipoR1和AdipoR2基因的cDNA全長分別為2 101 bp、2 035 bp和1 809 bp。在蘭州大尾羊中，APN基因在肌肉組織中高表達(dá)，AdipoR1和AdipoR2基因在內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪中高表達(dá)。