過氧化還原蛋白6 在慢性阻塞性肺疾病中的表達(dá)

徐文雨 朱默然 徐春燕 朱先極 沈 瑤

（復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院呼吸內(nèi)科 上海 201399）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統(tǒng)的常見病，其發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅人類健康。COPD 發(fā)病機(jī)制尚不明確，大量研究認(rèn)為其發(fā)病與氣道慢性炎癥、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激相關(guān)［1］，COPD 患者氧化應(yīng)激增加［2］。過氧化還原蛋白（peroxredoxins，Prdx）是硫醇特異性抗氧化蛋白家族［3］，包含6 個(gè)亞型，其中Prdx6 在肺中高表達(dá)，在肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞、支氣管Clara 細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中均可檢測到［4］。在Prdx6 缺乏小鼠中發(fā)現(xiàn)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷明顯加重，可能是Prdx6基因被敲除，aiPLA2 活性喪失，導(dǎo)致抗氧化作用減弱［5］。本文旨在探討Prdx6 在肺部疾病及COPD 的表達(dá)及與病情的相關(guān)性。

資料和方法

一般資料 回顧性分析2017 年1—7 月復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院呼吸科收治的支氣管擴(kuò)張、哮喘、肺炎各10 例患者，體檢中心正常體檢者30 例，COPD 急性加重期（AECOPD）30 例，COPD 穩(wěn)定期（COPD）30 例?；颊呔?jīng)肺功能檢查確診，存在不同程度的呼吸困難、氣短、咳痰、慢性咳嗽等癥狀，根據(jù)病情分為2 組，穩(wěn)定期組30 例，急性期組30 例，年齡45~75 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2015 年慢性阻塞 性 肺 病GOLD 指 南［6］，肺 功 能 檢 測 符 合 重 度COPD 標(biāo) 準(zhǔn)（30%≤FEV1 占 預(yù) 計(jì) 值 百 分 比<50%）；（2）無支氣管擴(kuò)張；（3）無支氣管哮喘；（4）無心力衰竭。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重肝腎功能不全；（2）癌癥；（3）血液系統(tǒng)疾??；（4）近3 個(gè)月使用免疫抑制劑；（5）嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病。30 例健康體檢者為對照組，年齡45~75 歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)［（2017）倫理審字（QWJWXKJS-09）號］，患者以及正常體檢者均簽署知情同意書。

ELISA 檢測血清Prdx6 用緩沖液將抗體稀釋至1~10 μg/mL。在反應(yīng)孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3 次。加稀釋血清0.05 mL 于上述反應(yīng)孔中，置于37 ℃孵育1 h，洗滌。于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.05 mL，37 ℃孵育0.5~1 h，洗滌；于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃顯色10~30 min；于各反應(yīng)孔中加入2 mol/L 硫酸0.05 mL，終止反應(yīng)。在ELISA 檢測儀上于450 nm 處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔D值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有結(jié)果均以x±s表示，組間差異和相關(guān)性分析采用t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析，單因素方差分析采用One-Way ANOVA。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果納入收治的支氣管擴(kuò)張、哮喘、肺炎患者以及AECOPD、COPD，各組與正常體檢組對比，性別及年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Prdx6 在COPD 患者急性期和穩(wěn)定期變化 血清Prdx6 水平COPD（34.50±15.58，P=0.001）、肺炎（27.94±19.15，P=0.002）、支 氣 管 擴(kuò) 張（35.32±8.75，P=0.001）、哮喘（38.97±11.27，P=0.001）等肺部疾病患者中均較正常體檢者（12.94±6.43）明顯增高，相對于COPD 穩(wěn)定期，急性加重期（41.37±17.64）血清Prdx6 明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048）。

COPD 急性期及穩(wěn)定期組內(nèi)按肺功能輕重度分為重度及極重度，對血清Prdx6 水平進(jìn)行亞組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管是急性期（極重度：48.63±18.81，重度：31.21±9.08，P=0.002）還是穩(wěn)定期（極重度：41.54±15.28，重度：25.29±10.64，P=0.003），極重度患者Prdx6 水平都明顯高于重度患者，提示Prdx6 水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

討論機(jī)體內(nèi)氧化代謝和抗氧化代謝失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)是參與及加重肺部炎癥的重要因素［7］。COPD 的臨床特點(diǎn)是慢性炎癥反應(yīng)，研究已證實(shí)COPD 患者的氧化應(yīng)激增加［2，8］。Prdx6 是一種具有雙功能活性的抗氧化酶，可以通過GSH-Px酶的功能清除肺內(nèi)過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而維持肺的穩(wěn)態(tài)；而一旦發(fā)生多種肺部病理損傷時(shí)，體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，Prdx6的iPLA2 酶活性上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性和組織損傷［9-13］。本研究的主要對象為COPD 患者，同時(shí)納入了支氣管擴(kuò)張、肺炎、哮喘及健康體檢者為對照，檢測外周血Prdx6 含量，研究結(jié)果提示機(jī)體發(fā)生肺部特異性或非特異性炎癥時(shí)，Prdx6 表達(dá)增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Prdx6 的表達(dá)水平與COPD 嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，因此我們推測隨著疾病進(jìn)展，炎癥因子不斷刺激導(dǎo)致體內(nèi)ROS 逐漸增加，機(jī)體需要更多的過氧化物酶來與之抗衡，致使極重度COPD 患者Prdx6 表達(dá)水平顯著升高。在其他呼吸系統(tǒng)疾病如矽肺的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，隨著石英等顆粒物濃度升高，人肺上皮細(xì)胞系中Prdx6 蛋白表達(dá)量逐漸升高［14］，這與本研究結(jié)果相似，可能因?yàn)榉蹓m刺激肺部，隨著時(shí)間不斷延長，肺組織內(nèi)沉積的石英濃度逐漸升高，這種刺激也會使ROS 水平升高，從而導(dǎo)致Prdx6表達(dá)水平升高來應(yīng)對加重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此我們考慮在肺部特異性或非特異性炎癥時(shí)Prdx6 表達(dá)量會上升，以減輕肺部疾病中的氧化應(yīng)激作用，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。Prdx6 在其他系統(tǒng)中也有研究：Prdx6 在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)較正常淋巴結(jié)高，同時(shí)Prdx6 高表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)［15］；在缺血缺氧肝細(xì)胞內(nèi)，Prdx6 表達(dá)較對照組有升高，氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，過表達(dá)的Prdx6可以減輕肝細(xì)胞損傷［16］。Prdx6 還與腫瘤進(jìn)展和癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。Prdx6 在宮頸癌組織中的表達(dá)普遍升高，Prdx6 過表達(dá)可刺激宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，顯著促進(jìn)宮頸癌在體內(nèi)的進(jìn)展［17］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Prdx6 在COPD 中表達(dá)增加，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，這將為尋求COPD 治療方法提供一個(gè)靶點(diǎn)。但是本研究尚有不足，下一步將繼續(xù)深入分子生物學(xué)研究并增加動物實(shí)驗(yàn)，探討Prdx6減輕COPD 中氧化應(yīng)激的具體作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)聲明徐文雨 論文構(gòu)思和撰寫，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。朱默然，徐春燕，朱先極 患者入組，數(shù)據(jù)采集，論文修訂。沈瑤 論文構(gòu)思和修訂，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。