IL-6反式信號傳導通路抑制劑sgp130Fc抑制膿毒癥小鼠炎性反應及調(diào)節(jié)免疫細胞

石丹丹，蔣素芳，王 茜，趙鵬博，劉 雅

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 麻醉科, 河北 石家莊 050000)

膿毒癥(sepsis)是由于宿主對感染的反應失調(diào)而導致的危及生命的器官功能障礙綜合征[1]，是全球重癥監(jiān)護病房(ICU)患者的主要死亡原因之一[2]。盡管目前在臨床認識、疾病定義和免疫病理生理學方面的進步已經(jīng)提高了膿毒癥的總體存活率，但膿毒癥的長期病死率仍然很高[3]，而幸存的膿毒癥患者表現(xiàn)出長期免疫功能障礙、免疫抑制、持續(xù)性炎性反應的狀態(tài)[4]。

白介素-6 (interleukin-6, IL-6)是一種多源性細胞因子，膿毒癥患者的血清中IL-6升高[5]。最近的研究表明，IL-6在血管中的促炎作用主要是通過其受體(sIL-6R)作用于IL-6反式信號傳導通路介導完成[6]。已知IL-6反式信號通路參與多種炎性疾病的發(fā)病機制，包括關節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肺纖維化和癌[7-9]，而選擇性抑制IL-6反式信號通路是否能改善膿毒癥尚不清楚。因此本研究擬利用膿毒癥模型小鼠，探討抑制IL-6反式信號通路對膿毒癥小鼠免疫炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡SPF級雄性 C57BL/6J小鼠80只(22～24 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司)，在22～25 ℃、12 h光暗循環(huán)照明下適應性飼養(yǎng)1周。鼠源sgp130Fc 蛋白(SinoBiologicl公司)；IL-6、IL-10、MCP-1及TNFα ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術有限公司)；紅細胞裂解液(Solarbio公司)；CD45 (PE-Cyanine7, clone 30-F11)、CD3e (FITC, clone 145-2C11)、 CD4 (PE, clone GK1.5)、 CD8a (PerCP-Cyanine5.5, clone 53-6.7)和 CD19 (APC, clone 1D3)(eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將80只小鼠隨機分為4組：假手術組(sham，n=15)、膿毒癥組[盲腸結(jié)扎穿孔術法制備膿毒癥模型[10]，cecum ligation and puncture(CLP)，n=30]、膿毒癥+抑制劑sgp130Fc組(CLP+sgp130Fc，n=20)和sgp130Fc組(sgp130Fc，n=15)。假手術組僅開腹后縫合。CLP術后1 h，sgp130Fc組與膿毒癥+sgp130Fc組腹腔注射sgp130Fc 0.5 mg/kg。

1.2.2 ELISA檢測血漿中IL-6、IL-10、MCP-1及TNFα 水平：CLP 術后 24 h，ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-10、MCP-1及TNFα 濃度。

1.2.3 流式細胞測量術檢測外周血免疫細胞比例：CLP術后 24 h，取外周血制備單細胞懸液；在制備的細胞懸液中加入相應的抗體：CD45(PE-Cyanine7, clone 30-F11)、 CD3e(FITC, clone 145-2C11)、 CD4(PE, clone GK1.5)、CD8a(PerCP-Cyanine5.5, clone 53-6.7)和CD19(APC, clone 1D3), 4 ℃ 避光孵育 30 min；4 ℃、300×g離心5 min，棄上清液；最后加入含0.1% BSA的PBS重懸細胞。使用BD FACSVerseTM流式細胞儀分析樣本，數(shù)據(jù)用FlowJo 軟件處理。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 抑制劑sgp130Fc治療對小鼠存活率的影響

與假手術組比較，膿毒癥組小鼠存活率明顯降低(P<0.05)；與膿毒癥組小鼠比較，膿毒癥+sgp130Fc組小鼠存活率明顯回升(P<0.05)(圖1); 假手術組小鼠和sgp130Fc組小鼠存活率均為 100%。

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05compared with CLP group圖1 抑制劑sgp130Fc對膿毒癥小鼠存活率的影響Fig 1 Effect of sgp130Fc on survival rate of mice

2.2 抑制劑sgp130Fc治療對體質(zhì)量的影響

與假手術組相比，膿毒癥組與膿毒癥+sgp130Fc組小鼠的體質(zhì)量明顯減少(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with sham group圖2 抑制劑sgp130Fc對膿毒癥小鼠體質(zhì)量的影響Fig 2 Effect of sgp130Fc on body weight of mice

2.3 各組小鼠炎性指標比較

CLP后24 h，與假手術組比較，膿毒癥組小鼠外周血中IL-6、 IL-10、 MCP-1和 TNFα 濃度升高(P<0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+sgp130Fc組IL-6、 IL-10、 MCP-1和TNFα 濃度回降(P<0.05)(圖3)。

2.4 各組小鼠外周血中免疫細胞的變化

CLP后24 h，與假手術組比較，膿毒癥組小鼠外周血 CD3+CD4+T淋巴細胞比例明顯降低，CD3+CD8+T淋巴細胞比例明顯升高，CD45+CD19+B淋巴細胞比例明顯降低(P<0.05); 與膿毒癥組比較，膿毒癥+sgp130Fc組小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細胞比例明顯升高，CD3+CD8+T淋巴細胞比例明顯降低，CD45+CD19+B 淋巴細胞比例明顯升高(P<0.05)(圖4)。

3 討論

炎性因子是膿毒癥發(fā)病機制中的一個重要因素，其中IL-6促進宿主防御感染和組織損傷，然而IL-6的過度合成會導致炎性因子風暴而引起急性嚴重全身炎性反應[11]。膿毒癥患者的IL-6在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均上調(diào)，且IL-6的水平相較其他炎性因子變化更為顯著[5]。雖然減少全身炎性反應有助于治療膿毒癥，但關于IL-6與膿毒癥免疫系統(tǒng)之間潛在關系的報道相對較少。本研究結(jié)果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組存活率明顯降低，IL-6較其他炎性因子變化更為明顯，提示IL-6在膿毒癥中發(fā)揮重要作用。

IL-6信號通路包括兩種：通過膜結(jié)合受體(mIL-6R)的經(jīng)典信號通路和通過可溶性受體(sIL-6R)的反式信號通路。在反式信號通路中，sIL-6R與循環(huán)中的IL-6結(jié)合，復合物與細胞膜上的gp130結(jié)合以啟動下游信號傳導。有證據(jù)表明，IL-6反式信號通路可能是IL-6諸多促炎性作用的原因，經(jīng)典信號通路則為抑炎作用[6]?，F(xiàn)有的抗IL-6治療藥物同時抑制經(jīng)典信號和反式信號，而近年研究顯示同時抑制兩條信號通路的IL-6靶向抗炎方法在膿毒癥的治療中失敗[12]。Sgp130Fc通過與sIL-6R-IL-6復合體結(jié)合而阻止其與細胞膜上的gp130受體結(jié)合，選擇性抑制反式信號通路，且阻斷IL-6反式傳導信號不會損害人體對細菌感染的防御[13]，因此sgp130Fc是一種比IL-6或IL-6R抗體更好的IL-6阻斷藥物。

淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的主要細胞，參與重要的體液免疫應答和細胞免疫應答。CD3+T 代表總T淋巴細胞，主要分為CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞, 機體感染時CD4+T細胞對免疫系統(tǒng)發(fā)出防御信息，CD8+T細胞抑制和抗擊感染細胞[14]。膿毒癥的免疫反應在數(shù)小時內(nèi)從早期的高炎性反應階段轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥诘牡脱仔苑磻兔庖咭种齐A段，這些不同的免疫狀態(tài)的特點是免疫監(jiān)視功能受損，進而發(fā)展為持續(xù)性、復發(fā)性、繼發(fā)性的感染，進而導致死亡率增加[4]。本研究使用小鼠膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)通過使用sgp130Fc抑制IL-6反式信號通路可以有效減輕膿毒癥小鼠炎性反應，調(diào)節(jié)免疫細胞的平衡而改善膿毒癥小鼠的相關癥狀和表現(xiàn)，提高存活率。這表明IL-6反式信號通路與膿毒癥免疫炎性反應失衡有關，但其具體作用機制還需要進一步實驗探索。

綜上所述，抑制 IL-6反式信號通路可通過降低炎性因子水平和調(diào)節(jié)免疫細胞的失衡從而降低膿毒癥的病死率，顯示了sgp130Fc在免疫治療膿毒癥中的潛力。