依托咪酯減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

景建闖，張志軍

(安陽(yáng)市人民醫(yī)院 麻醉科， 河南 安陽(yáng) 455000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、中性粒細(xì)胞聚集以及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生而導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)炎性反應(yīng)為主的病理改變[1]。雖然對(duì)ALI的研究和治療取得了突破性進(jìn)展，但ALI病死率仍高達(dá)30%～50%[2]。因此研究高效的防治ALI藥物具有重要的臨床意義。依托咪酯是咪唑類衍生物，屬于臨床常見(jiàn)的靜脈麻醉藥物之一，對(duì)內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠具有保護(hù)作用[3]。依托咪酯對(duì)該信號(hào)通路影響以及減輕急性肺損傷的作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以脂多糖(lipopolysaccha-ride，LPS)氣管滴注法建立ALI小鼠，探討依托咪酯對(duì)ALI小鼠信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：120只清潔級(jí)、雄性、C57bL/6小鼠，體質(zhì)量20～22 g[北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2020-0004]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：依托咪酯(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；LPS(默克公司)；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TXNIP、NLRP3一抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：將90只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(氣管滴注10 mg/kg LPS溶液建立ALI小鼠模型)[4]、依托咪酯低(5.0 mg/kg)、中(10.0 mg/kg)、高劑量(20.0 mg/kg)組[5]、陽(yáng)性對(duì)照(血必凈注射液，100 μL)組[6]，每組15只。為明確TXNIP/NLRP3信號(hào)通路在ALI治療過(guò)程中的作用，給予依托咪酯高劑量組治療同時(shí)加入TXNIP過(guò)表達(dá)載體(pcDNA3.1-TXNIP，5 nmol/L)，組別設(shè)置為依托咪酯高劑量+TXNIP空載體(pcDNA3.1)組、依托咪酯高劑量+pcDNA3.1-TXNIP組[7]，每組15只。腹腔注射相應(yīng)劑量藥物，皮下注射相應(yīng)載體，每天1次，連續(xù)給藥10 d。末次給藥結(jié)束2 h后，對(duì)照組氣管滴注等體積的0.9% NaCl溶液，其余各組均采用氣管滴注10 mg/kg LPS溶液建立ALI小鼠模型。

1.2.2 檢測(cè)小鼠呼吸功能：用Buxco小動(dòng)物呼吸肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)小鼠呼吸功能，待波形穩(wěn)定后記錄呼吸頻率(breath/min)、氣道阻力(cmH2O)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(L/cmH2O)。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血清中炎性因子水平：取腹部主動(dòng)脈血液，分離血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α含量。

1.2.4 測(cè)定肺臟濕/干重(W/D)比值：各組隨機(jī)選取5只小鼠，稱量并記錄濕重；置于80 ℃恒溫箱中干燥48 h以上，稱量并記錄干重，計(jì)算肺臟W/D比值。

1.2.5 HE染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)及損傷評(píng)分：各組剩余10只小鼠麻醉并處死，取出肺組織，制備切片，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行病理學(xué)觀察。肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)主要觀察肺泡壁增厚以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，無(wú)損傷是0分，輕度損傷是1分，中度損傷是2分，嚴(yán)重?fù)p傷是3分。

1.2.6 Western blot檢測(cè)肺組織中TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)：加入裂解液制備肺組織勻漿，離心提取總蛋白，ABC法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉。加入稀釋后的TXNIP、NLRP3一抗,4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。加入稀釋后的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL顯色、拍照。以β-actin為內(nèi)參，測(cè)定吸光度值，定量分析TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 依托咪酯對(duì)ALI小鼠呼吸功能的影響

與對(duì)照組相比，模型組肺順應(yīng)性、呼吸頻率顯著降低(P<0.05)，氣道阻力顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，依托咪酯低、中、高劑量組肺順應(yīng)性、呼吸頻率均呈現(xiàn)劑量依賴性增加(P<0.05)，而氣道阻力下降(P<0.05)(表1)。

2.2 依托咪酯對(duì)ALI小鼠血清中炎性因子水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，依托咪酯低、中、高劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平呈現(xiàn)劑量依賴性降低(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠血清中IL-6和TNF-α水平

2.3 依托咪酯對(duì)ALI小鼠肺臟W/D比值影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺臟W/D顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，依托咪酯低、中、高劑量組小鼠肺臟W/D呈現(xiàn)劑量依賴性降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組小鼠肺臟W/D比值

2.4 依托咪酯對(duì)ALI小鼠病理學(xué)變化及肺組織損傷評(píng)分的影響

對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡壁增厚；與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重， 出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、 水腫、 肺泡壁增厚現(xiàn)象，肺組織損傷評(píng)分顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，依托咪酯低、中、高劑量組隨著劑量的增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、肺泡壁增厚均得到不同程度的緩解，肺組織損傷評(píng)分逐漸下降(P<0.05)(圖1，表4)。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化Fig 1 Lung tissue pathology change of mice in each group(HE, ×400)

表4 依托咪酯對(duì)ALI小鼠肺損傷評(píng)分的影響

2.5 依托咪酯對(duì)小鼠肺組織中TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)均增加(P<0.05)；與模型組相比，隨著依托咪酯劑量的增加，TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)逐漸降低(P<0.05)(圖2，表5)。

A.control; B.model; C.L-etomidate; D.M-etomidate; E.H-etomidate; F.positive圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)Fig 2 TXNIP and NLRP3 protein expression in lung tissue of mice by Western blot

表5 各組小鼠肺組織TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)

2.6 過(guò)表達(dá)TXNIP對(duì)ALI小鼠呼吸功能及TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)的影響

與依托咪酯高劑量+pcDNA3.1組相比，依托咪酯高劑量+pcDNA3.1-TXNIP組小鼠肺順應(yīng)性、呼吸頻率顯著降低(P<0.05)，氣道阻力、TXNIP、NLRP3表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖3，表6)。

3 討論

ALI為嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，主要是肺部炎性反應(yīng)引起肺間質(zhì)水腫、肺順應(yīng)性惡化， 病情發(fā)展迅速， 病死率高， 且ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚無(wú)有效安全的藥物治療[8]。因此，明確其發(fā)病機(jī)制、尋找高效防治ALI藥物成為國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。LPS可使機(jī)體先天性免疫功能受損，引發(fā)ARDS、全身炎性反應(yīng)以及致命性多器官功能衰竭，常被用作制備ALI動(dòng)物模型[9]。本實(shí)驗(yàn)采用氣管滴注LPS溶液建立ALI小鼠模型，。

依托咪酯作為非巴比妥類靜脈麻醉藥的一種，具有強(qiáng)而短效的特點(diǎn)，降低患者躁動(dòng)發(fā)生的概率和程度，在許多疾病治療以及大型手術(shù)中療效顯著，具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。研究發(fā)現(xiàn)依托咪酯可以抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)依托咪酯隨著劑量變化，可以不同程度地改善炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚，增加肺順應(yīng)性、呼吸頻率，降低肺組織病理評(píng)分、氣道阻力、肺臟W/D，提示依托咪酯可減輕LPS誘導(dǎo)的ALI，但具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

氣管滴注LPS建立ALI小鼠模型時(shí)，LPS會(huì)破壞巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的活化，從而導(dǎo)致促炎因子如TNF-α、IL-6等的大量釋放，進(jìn)而募集中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺部，引起炎性瀑布反應(yīng)，進(jìn)而造成組織損傷。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)依托咪酯干預(yù)后，IL-6、TNF-α水平顯著降低，表明依托咪酯可能通過(guò)抑制IL-6、TNF-α水平改善LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠癥狀。研究表明，TXNIP/NLRP3信號(hào)通路與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。NLRP3炎性反應(yīng)小體在ALI炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，可以誘導(dǎo)TXNIP從硫氧還蛋白中解離，與NLRP3結(jié)合形成炎性復(fù)合物，促進(jìn)炎性因子的釋放， 產(chǎn)生炎性反應(yīng)， 導(dǎo)致ALI的發(fā)生[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組肺組織中TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)均增加，經(jīng)依托咪酯干預(yù)后，TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)降低。表明LPS通過(guò)激活TXNIP/NLRP3信號(hào)通路，促進(jìn)炎性因子的釋放，而依托咪酯可有效抑制炎性反應(yīng)，這可能與抑制TXNIP/NLRP3信號(hào)通路有關(guān)，為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，實(shí)驗(yàn)引入pcDNA3.1-TXNIP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-TXNIP可逆轉(zhuǎn)依托咪酯對(duì)小鼠的保護(hù)作用。

綜上所述，依托咪酯可以減輕炎性反應(yīng)，減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠癥狀，其機(jī)制可能與抑制TXNIP/NLRP3信號(hào)通路有關(guān)，但由于依托咪酯改善LPS誘導(dǎo)的ALI的機(jī)制較為復(fù)雜，仍需要進(jìn)一步探索。