缺血預(yù)處理減輕兔股動(dòng)脈穿刺所致的血管內(nèi)皮損傷

劉 鵬，李凱園，楊 陽(yáng)，滿藝龍，杜鳳立，劉 淼*

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250000；2.山東省公共衛(wèi)生臨床中心,山東 濟(jì)南 250000)

經(jīng)橈動(dòng)脈(through radial artery, TRA)行冠狀動(dòng)脈介入治療因其術(shù)后并發(fā)癥少，臥床時(shí)間短，住院費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)而被介入科醫(yī)生和患者所接受。然而TRA后使用壓迫裝置止血易導(dǎo)致橈動(dòng)脈血管閉塞和血腫[1]。

缺血預(yù)處理(ischemia preconditioning, IP)可以減少對(duì)心肌梗死后的心肌再灌注損傷，其機(jī)制是通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)內(nèi)皮一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, eNOS)活性[2]。有報(bào)道IP顯著降低TRA后橈動(dòng)脈閉塞的發(fā)生率，其機(jī)制可能與IP保護(hù)心肌再灌注損傷有關(guān)，即IP通過(guò)激活PI3K/AKT增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性[3]。PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)是多種調(diào)節(jié)因子中相對(duì)重要的調(diào)節(jié)途徑，活化的PI3K可磷酸化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，形成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)激活A(yù)KT，與細(xì)胞膜上PIP3絲/蘇氨酸激酶相互作用[4-5]。PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路的保護(hù)作用已在許多研究中得到證實(shí)[6]。本研究通過(guò)構(gòu)建動(dòng)脈損傷模型，探討IP是否通過(guò)激活PI3K/AKT/eNOS減輕機(jī)械損傷后的股動(dòng)脈內(nèi)皮損傷[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：EILSA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(艾科瑞生物有限公司)，PCR引物(深圳華大基因股份有限公司)，anti-PI3K、anti-AKT、anti-eNOS、β-actin和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG二抗(安諾倫生物科技有限公司)。

1.1.2 動(dòng)物：28只SPF級(jí)雄性新西蘭白兔，體質(zhì)量(3.5±0.5)kg(北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和方案均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 “實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”，本研究經(jīng)濟(jì)南市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)：JNCH2021-21)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：隨機(jī)選擇4只兔建立股動(dòng)脈損傷模型的預(yù)實(shí)驗(yàn)。將兔置于固定箱中，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30 mg/kg。麻醉成功后，在超聲引導(dǎo)下穿刺右股動(dòng)脈，隨后將4-French橈動(dòng)脈鞘管插入兔右股動(dòng)脈(4～5 cm)，通過(guò)鞘管注射肝素并保留在股動(dòng)脈中10 min，超聲下觀察血管內(nèi)導(dǎo)絲來(lái)回伸縮數(shù)次，證明機(jī)械損傷建模成功。10 min后，取出導(dǎo)絲和鞘管。壓迫股動(dòng)脈穿刺部位15 min，用繃帶包扎。24 h后，去除繃帶。

其余24只兔隨機(jī)分為4組，每組6只：對(duì)照組(control)、缺血預(yù)處理組(ischemic preconditioning,IP組)、股動(dòng)脈穿刺組(femoral artery puncture,P組)和缺血預(yù)處理+股動(dòng)脈穿刺組(preconditioning+femoral artery puncture,IP-P組)。對(duì)照組：不進(jìn)行任何干預(yù)。IP組：對(duì)兔右下肢進(jìn)行IP，但不穿刺股動(dòng)脈，具體步驟：使用壓脈帶將兔右下肢捆綁壓迫5 min，股動(dòng)脈波動(dòng)消失，兔右下肢皮膚由粉紅色變?yōu)樽仙?，然后松開壓脈帶5 min，股動(dòng)脈恢復(fù)搏動(dòng)，皮膚由紫色變?yōu)榉奂t色，重復(fù)4次。P組：如上穿刺方法干預(yù)兔右股動(dòng)脈。IP-P組：先將兔右股動(dòng)脈進(jìn)行IP，1.5 h后進(jìn)行穿刺。4組全部在干預(yù)24 h后收集靜脈血并截取股動(dòng)脈(圖1)。

A.femoral artery puncture in experimental rabbits; B.ultrasound guided puncture圖1 兔股動(dòng)脈穿刺及超聲引導(dǎo)下驗(yàn)證Fig 1 Femoral artery puncture and ultrasound-guided verification in rabbits

1.2.2 樣品的采集和處理：結(jié)扎兔右側(cè)股動(dòng)脈的近端和遠(yuǎn)端，用眼科剪取1～2 cm血管，立即置于4%多聚甲醛固定液中，放-80 ℃冰箱中冷凍保存。靜脈血在4 ℃、2 000 r/min離心10 min，隨后吸出血漿，分裝到6個(gè)離心管中，每個(gè)離心管200 μL，放-80 ℃中冷凍保存。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血漿NO：根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血漿NO含量，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔A值。

1.2.4 HE染色檢測(cè)血管病理及免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮eNOS表達(dá)：將實(shí)驗(yàn)兔血管石蠟切片進(jìn)行HE染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)。使用Image J軟件檢測(cè)陽(yáng)性區(qū)域吸光度值。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)血管內(nèi)皮中eNOS mRNA表達(dá)：用Trizol試劑與血管組織研磨混勻，離心取上清液后加入氯仿再次離心，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。取最上層溶液，加入異丙醇再次離心，棄上清液。管中加入75%乙醇再次離心5 min，沉淀即為RNA，使用分光光度儀測(cè)量RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR使用Evo M-MLV RT Mix Kit和 Real-Time PCR System using SYBR Green Premix Pro Tag HS qPCR kit，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。eNOS引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.6 Western blot檢測(cè)p-AKT和p-eNOS的表達(dá)：將血管組織放入無(wú)酶的1.5 mL試管中，加入RIPA裂解液和PMSF，提取蛋白裂解液。用SDS-PAGE對(duì)蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜封閉，加入一抗4 ℃過(guò)夜，第二天加二抗，用化學(xué)發(fā)光儀顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血管病理改變及PI3K、AKT和eNOS在血管內(nèi)皮中的表達(dá)

對(duì)照組和IP組股動(dòng)脈內(nèi)膜完整，連續(xù)彈性膜，內(nèi)皮細(xì)胞清晰可見，P組和IP-P組部分內(nèi)皮細(xì)胞丟失，彈性膜破裂，部分中膜退化 (圖2)。IP組股動(dòng)脈血管內(nèi)皮中P13K、 AKT和eNOS蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組和P組，IP組和IP-P組中PI3K、AKT和eNOS指數(shù)吸光度值比對(duì)照組和P組升高(P<0.05)，IP-P組eNOS表達(dá)量比IP組減少(P<0.05)(圖3)。

圖2 各組股動(dòng)脈HE染色Fig 2 HE staining of femoral artery in each group

A.the relative expression of PI3K, AKT and eNOS in each group was determined by immunohistochemistry; B.statistical analysis of relative expression level; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with P group

2.2 IP-P組血管內(nèi)皮中p-AKT和p-eNOS的蛋白表達(dá)升高

24 h后，對(duì)照組和P組p-AKT和p-eNOS蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，P組和IP-P組p-AKT和p-eNOS蛋白表達(dá)比對(duì)照組和P組升高(P<0.05)(圖4)。

A.protein expression of p-eNOS and p-AKT in each group; B.statistical analysis of relative expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with P group

2.3 IP-P組血管內(nèi)皮eNOS的mRNA表達(dá)升高

對(duì)照組股動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在微量eNOS，單獨(dú)穿刺治療后eNOS表達(dá)無(wú)明顯變化，P組和IP-P組eNOS表達(dá)比對(duì)照組和P組升高(P<0.05)(圖5A)。

A.mRNA expression of eNOS in each group; B.pre-puncture plasma NO; C.post-puncture plasma NO; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with P group

2.4 各組血漿NO變化

各組股動(dòng)脈內(nèi)徑無(wú)顯著差異(表2)。術(shù)前各組血漿NO水平基本無(wú)變化。IP組和IP-P組血漿NO水平高于對(duì)照組和P組(P<0.01)(圖5B～C)。

表2 各組股動(dòng)脈內(nèi)徑Table 2 Diameter of femoral artery in each

3 討論

TRA相比股動(dòng)脈穿刺(through femoral artery, TFA)能有效降低穿刺點(diǎn)出血并發(fā)癥，減少住院時(shí)間，并提高患者術(shù)后生活質(zhì)量，為中國(guó)大多數(shù)介入醫(yī)生的首選。曾有報(bào)道IP顯著降低TRA后橈動(dòng)脈閉塞率和其他并發(fā)癥[8]。

IP可以激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)并迅速產(chǎn)生自我保護(hù)機(jī)制[9]。肝移植和腎移植手術(shù)過(guò)程中，IP可以減少急性腎損傷等相應(yīng)并發(fā)癥的發(fā)生[10]。有學(xué)者已通過(guò)二代測(cè)序找到相關(guān)的非編碼RNA， 有望成為今后的治療靶點(diǎn)[11]。缺乏caveolin-3的小鼠在模擬心臟損傷前進(jìn)行IP可以起到心臟保護(hù)作用， 通過(guò)激活PI3K/AKT減少心肌梗死面積[12]。H2S預(yù)處理預(yù)處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞可以增強(qiáng)IP處理后的磷酸化，刺激 eNOS 表達(dá)和內(nèi)源性NO的產(chǎn)生，激活環(huán)鳥苷酸通路，保護(hù)線粒體功能，減少血管內(nèi)皮損傷[13]。eNOS是NOS同工酶家族的3種亞型之一，是參與NO合成的限速酶之一。在PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路中，NO激活鳥苷酸環(huán)化酶循環(huán)-環(huán)鳥苷酸通路和轉(zhuǎn)錄蛋白激酶C，保護(hù)線粒體。

本研究用兔股動(dòng)脈損傷模型模擬橈動(dòng)脈損傷，發(fā)現(xiàn)IP可通過(guò)激活PI3K/AKT通路保護(hù)血管內(nèi)皮，激活內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的磷酸化，促進(jìn)NO的合成。IP組和IP-P組血管內(nèi)皮的eNOS表達(dá)明顯高于對(duì)照組和P組。AKT和eNOS的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和P組，eNOS的mRNA在IP組和IP-P組均升高，IP組和IP-P組血漿NO表達(dá)明顯高于對(duì)照組和P組。綜上所述，IP可以促進(jìn)兔血管內(nèi)皮eNOS磷酸化和NO合成，這可能是IP減少穿刺損傷的機(jī)制之一。