花生AhbZIP4基因克隆及其在側(cè)枝發(fā)育中的表達(dá)分析

韋麗君，苗鵬慧，孫賽楠，李楚珩，楊鑫雷

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華北作物種質(zhì)資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001）

花生是世界重要的油料作物和植物蛋白來源之一［1］。按照生長習(xí)性花生可以劃分為直立型、半匍匐型和匍匐型三種植株形態(tài)［2］，而生長習(xí)性的建成主要受花生側(cè)枝發(fā)育的影響。側(cè)枝擺脫地心引力向上生長或屈服地心引力平伏生長，直接影響花生果針的入土距離、結(jié)果集中程度和耕作方式。魯清等［3］研究認(rèn)為適量增加側(cè)枝與主莖的夾角，可有效減小果針入土距離，便于機(jī)械化收獲，增加單株產(chǎn)量。

目前，關(guān)于植物側(cè)枝的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素、植物激素、種植密度、糖類、營養(yǎng)物質(zhì)和基因表達(dá)水平都參與植物側(cè)枝調(diào)控［4］。轉(zhuǎn)錄因子在分枝發(fā)育過程中起著不可疏忽的重要調(diào)控作用，前人在水稻［5］、玉米［6］和番茄［7］等多種植物中均驗(yàn)證與分枝發(fā)育相關(guān)的重要基因。堿性亮氨酸拉鏈（Basic region/leucine zipper motif，bZIP）類轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于在真核生物中且相對保守，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病害及脅迫應(yīng)答等多種信號反應(yīng)［8］。擬南芥AtbZIP60轉(zhuǎn)錄激活后與AtMYB7互作協(xié)同拮抗ABA 信號，促進(jìn)種子萌發(fā)［9］。擬南芥GRF9通過激活表達(dá)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子OBP3-RESPONSIVE GENE3（ORG3），負(fù)調(diào)控葉片生長，表現(xiàn)為葉片變?。?0］。CmbZIP1主要在菊花的頂芽和腋芽中表達(dá)，過表達(dá)轉(zhuǎn)CmbZIP1擬南芥較野生型分枝數(shù)變少［11］。水稻OsbZIP49過表達(dá)可使分蘗夾角增加，株型變得松散，主要是通過誘導(dǎo)IAA 酰胺合成酶來控制水稻的分蘗角和株型［12］。另外，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的明星基因HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）可通過光信號間接影響特異性激素等基因通路來調(diào)控植物生長發(fā)育，轉(zhuǎn)HY5擬南芥較野生型擬南芥植株分枝數(shù)顯著增加［13-14］。在花生中，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的功能研究多與逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)［15-16］，而與生長發(fā)育的相關(guān)研究鮮見報道。

本研究在課題組前期花生bZIP 全基因組鑒定［15］和花生側(cè)枝發(fā)育表達(dá)譜數(shù)據(jù)中［17］，發(fā)現(xiàn)AhbZIP4在不同生長習(xí)性的花生品種中表現(xiàn)出顯著表達(dá)差異，推測其可能與側(cè)枝發(fā)育相關(guān)。因此，本研究通過克隆、分析AhbZIP4基因的特征特性，構(gòu)建融合載體明確基因在細(xì)胞中的表達(dá)位置；采用組織特異性表達(dá)分析探究基因在不同組織，尤其是在側(cè)枝發(fā)育中的表達(dá)模式。研究結(jié)果將為花生側(cè)枝發(fā)育提供新的基因資源，對進(jìn)一步明確AhbZIP4基因參與調(diào)控側(cè)枝發(fā)育的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用側(cè)枝生長習(xí)性直立花生品種‘冀花5 號’（JH5）和匍匐花生品系M130，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)花生分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。于2020 年4 月種植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新生態(tài)園日光溫室內(nèi)，生長條件為白天28 ～30 ℃/16 h，晚上24 ～26 ℃/8 h，晝夜?jié)穸瓤刂圃?0%～70%。在苗期（播種后15 d）、開花期（播種后65 d）和結(jié)莢期（播種后100 d）分別取根、主莖、側(cè)枝、葉、花等5 個器官組織；催芽播種后5、10、15、20、25 和30 d 的側(cè)枝取樣參考高斌［17］的方法。所有樣品均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，速凍于液氮中，存放于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1AhbZIP4基因的獲得 課題組前期通過直立型花生品種‘冀花5 號’和匍匐型種質(zhì)資源M130 的側(cè)枝發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（BioProject ID: PRJNA675413）獲得差異表達(dá)基因AhbZIP4。本研究從直立型品種JH5 葉片中，采用RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)）提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA（全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒）。根據(jù)AhbZIP4基因的CDS 序列，設(shè)計(jì)引物（見表1）。以1 μL cDNA 為模板，分別加入Pfu PCR Mix 25 μL、特 異 性 引 物 各1 μL，PCR 反 應(yīng) 總 體 積 為50 μL。PCR 反 應(yīng) 程 序 為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增條帶回收（Tiangen DNA 凝膠回收試劑盒）并送金唯智公司測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）、TMHMM2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/）、SignalP（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）等在線軟件分析基因蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽等信息。采用Mega7.0 和GENEDOC 軟件進(jìn)行序列進(jìn)化分析和多重序列比對分析。

1.2.3AhbZIP4基因亞細(xì)胞定位 采用限制性內(nèi)切酶BsaⅠ和Eco31Ⅰ將PCR 產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pBWA(V)HS-Glosgfp（武漢伯遠(yuǎn)）進(jìn)行37℃雙酶切1 h，獲得線性化載體和目的片段；而后，采用T4 連接酶（Promega 公司）連接線性化載體和目的片段，連接體系為T4連接酶1 μL，10×buffer 1 μL，純化產(chǎn)物2.5 μL，補(bǔ)超純水至10 μL，16 ℃，3 h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 鑒定陽性單菌落。將載體pBWA(V)HS-AhbZIP4-Glosgfp 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)，注射煙草葉片下表皮，弱光培養(yǎng)2 d，取標(biāo)記的煙草葉片，制成玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 基因表達(dá)分析 實(shí)時熒光定量PCR 儀器為LightCycler 96 實(shí)時熒光定量PCR 儀，試劑為RT mix with DNase 升級款（購自蘇州宇恒生物科技有限公司）。根據(jù)NCBI primer-Blast 設(shè)計(jì)qPCR 引物，以UBI1 為內(nèi)參基因（表1）。反應(yīng)體系和程序參考高斌的方法［17］。采用2-△△Ct方法［18］計(jì)算該基因在不同品種、不同時期、不同組織中的相對表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Graphpad Prism 8.0 軟件。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

2 結(jié)果與分析

2.1AhbZIP4基因克隆

以直立型花生JH5 葉片的cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，利用Primer Premier5 設(shè)計(jì)特異性引物，PCR 克隆獲得基因編碼序列全長，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示目的條帶在1 182 bp 位置（圖1），膠回收純化后測序，測序結(jié)果顯示與基因的CDS 序列一致，表明已成功克隆AhbZIP4基因（arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.CS824N.1）的編碼區(qū)，該基因位于四倍體栽培花生A01 染色體14 108 058 ～14 113 355 bp 位置。

圖1 花生AhbZIP4基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 DNA Ladder ofAhbZIP4gene

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白理化性質(zhì)和二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 該基因cDNA 全長1 182 bp，編碼393 個氨基酸。編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為42.10 kD，等電點(diǎn)pI 為7.14，疏水性為-0.779。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示（圖2 左），該基因氨基酸序列α 螺旋占26.5%，無規(guī)則卷曲占65.75%，β 轉(zhuǎn)角占3.25%和占4.5%的延伸鏈；根據(jù)基因的氨基酸序列預(yù)測蛋白三維模型（圖2 右），顯示該蛋白呈現(xiàn)典型的bZIP 拉鏈結(jié)構(gòu)。

圖2 AhbZIP4 蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Prediction of secondary and tertiary structure of AhbZIP4 protein

2.2.2 信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位預(yù)測 信號肽分析結(jié)果顯示該蛋白無信號肽（圖3 左），推測此蛋白是非分泌性蛋白，不能進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，一般在合成處發(fā)揮作用?？缒そY(jié)構(gòu)域分析（圖3 右），紫色線顯示蛋白在outside 的概率幾乎為100%，表明此蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，從而推測此蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成后不進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)而是在細(xì)胞內(nèi)部行使功能。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示該基因定位在細(xì)胞核（95.7%）和細(xì)胞膜（4.3%）。

圖3 AhbZIP4 信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域Fig. 3 AhbZIP4 signal peptide and protein transmembrane region

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析和多重序列比對分析 將AhbZIP4基因序列利用NCBI-Blast 得到的同源序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示（圖4），花生AhbZIP4 與大豆的GBF2A 和GBF2 以及紅車軸草的WBR2同源性較高。多重比對分析顯示（圖5），AhbZIP4與同為豆科的作物氨基酸序列一致性較高，AhbZIP4 蛋白的同源序列存在2 個保守區(qū)域，為MFMR 和亮氨酸拉鏈(bZIP)區(qū)域（60 ～80 個氨基酸），MFMR 是G-box 家族的結(jié)合蛋白，可與bZIP 特異結(jié)合形成特異蛋白。

圖4 AhbZIP4 蛋白的同源序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of homologous sequence of AhbZIP4 protein

圖5AhbZIP4氨基酸序列的多重比對分析Fig. 5 Multiple alignment ofAhbZIP4amino acid sequences

2.3AhbZIP4基因的亞細(xì)胞定位

利用BsaⅠ和Eco31Ⅰ將測序正確的PCR 產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pBWA(V)HS-Glosgfp 進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將PCR 產(chǎn)物和線性化載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單菌落進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示與該基因CDS 序列一致，表明重組質(zhì)粒pBWA(V)HS-AhbZIP4-Glosgfp 構(gòu)建成功（圖6 左）。將重組質(zhì)粒pBWA(V)HS-AhbZIP4-Glosgfp 轉(zhuǎn)入煙草葉片，在熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示AhbZIP4的綠色熒光信號分布于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中（圖6 右），表明AhbZIP4定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果相符。

圖6 AhbZIP4-GFP 載體圖及亞細(xì)胞定位Fig. 6 Vector profile of AhbZIP4-GFP and subcellular localization

2.4AhbZIP4基因的組織特異性表達(dá)

為進(jìn)一步探究AhbZIP4與側(cè)枝發(fā)育的關(guān)系，我們檢測了其在JH5 和M130 苗期、開花期和結(jié)莢期的根、主莖、側(cè)枝、葉片和花中的表達(dá)特征。結(jié)果顯示，AhbZIP4基因除在結(jié)莢期時的花中表達(dá)差異不顯著，其他生育期的不同組織中均呈現(xiàn)顯著或極顯著表達(dá)差異，在2 個品種不同生育時期側(cè)枝中的表達(dá)量變化趨勢不同（圖7）。苗期2 個品種在側(cè)枝中基因表達(dá)量極顯著差異與轉(zhuǎn)錄組側(cè)枝發(fā)育關(guān)鍵時期差異相符（圖8），推測該基因表達(dá)量的變化與側(cè)枝發(fā)育的變化相關(guān)，從而間接影響花生株型的分化。

圖7AhbZIP4在兩個品種不同組織的表達(dá)模式分析Fig. 7 Expression pattern ofAhbZIP4gene in the two varieties of different organizations

圖8AhbZIP4基因在不同品種側(cè)枝和側(cè)枝發(fā)育5～30 d 的表達(dá)變化趨勢Fig. 8 Characteristics of the changing trend ofAhbZIP4gene expression in the development of lateral branches of different cultivars for 5-30 days

3 討論

植物分枝習(xí)性長期以來備受育種家們關(guān)注，合理的分枝習(xí)性有利于作物產(chǎn)量提高和耕作方式優(yōu)化。近年來，作物分枝習(xí)性的基因挖掘和作用機(jī)制的解析已在擬南芥和禾谷類作物中取得較大的進(jìn)展［19-21］，大多數(shù)基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于植物中，其家族成員都具有一個高度保守的bZIP 結(jié)構(gòu)域（60～80 個氨基酸）。它由兩部分組成：高度保守的結(jié)合DNA 的堿性區(qū)和多變的亮氨酸拉鏈區(qū)。在所有真核生物中都存在含有bZIP 結(jié)構(gòu)域的蛋白，此類轉(zhuǎn)錄因子主要定位于細(xì)胞核中。本研究前期利用花生側(cè)枝生長習(xí)性轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)AhbZIP4基因在直立型品種JH5 中和匍匐型品系M130 中存在顯著表達(dá)差異，推測該基因可能參與花生分枝習(xí)性的建成。本研究克隆的AhbZIP4基因具有典型的bZIP 結(jié)構(gòu)域，且與前期栽培種花生bZIP 全基因組鑒定的結(jié)果一致［15］。前人研究中bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白主要定位于細(xì)胞核中，部分定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等其他細(xì)胞器中，外部環(huán)境以及蛋白互作也會對蛋白定位產(chǎn)生影響［17,22-25］。本研究中AhbZIP4 蛋白定位于細(xì)胞核與細(xì)胞膜中，與前人研究結(jié)果相符，定位于細(xì)胞膜是否與其他因素相關(guān)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

迄今為止，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子已被證明參與了多種生物學(xué)進(jìn)程［26］。水稻中3 個bZIP 轉(zhuǎn)錄因子OsbZIP23、OsbZIP66 和OsbZIP72 與OsMFT2 相互作用且正向調(diào)控ABA 應(yīng)答基因，并延緩種子萌發(fā)［27］。擬南芥AtbZIP29參與調(diào)控根尖分生組織細(xì)胞中細(xì)胞壁形成相關(guān)基因的表達(dá)從而抑制根的生長發(fā)育［28］。楊柳科樹種楊樹中推測bZIP 可能參與了枝條的次生生長［29］。擬南芥GBF1（bZIP）蛋白被Z-box 編碼，在幼苗光形態(tài)發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，如抑制側(cè)根的發(fā)育和促進(jìn)子葉的擴(kuò)展［30］。本研究克隆的AhbZIP4基因與大豆GBF2 和GBF2A 具有較高的同源性，它們均屬于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族G 亞族，該亞族成員能夠特異結(jié)合光應(yīng)答順式作用元件G-box，推測AhbZIP4 基因可能通過光信號來調(diào)控分枝習(xí)性。正常光照條件下，本研究中花生側(cè)枝發(fā)育5 ～30 d轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，AhbZIP4基因在15 ～25 d 之間側(cè)枝習(xí)性直立的品種表達(dá)量明顯高于匍匐型，推測該基因可能與不同株型品種植株形態(tài)分化相關(guān)。本研究中AhbZIP4基因在側(cè)枝發(fā)育過程中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示bZIP 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花生側(cè)枝生長習(xí)性提供理論參考。