PTC-T542乳粉中沙門氏菌檢測能力驗證 結果與分析

◎ 馬小筱

（廣州市番禺質(zhì)量技術監(jiān)督檢測所，廣東 廣州 511400）

沙門氏菌（Salmonellaspp.）是一種常見的人畜共患病原菌，對人類和動物都有極大危害。食物傳播是人類感染沙門氏菌的主要途徑，尤其是近年來，方便快餐、快熟食品、冷凍食品的盛行，在增加沙門氏菌污染可能性的同時也加大了沙門氏菌檢出的難度，因此通過參加能力驗證來提高檢測人員素質(zhì)，增加檢驗經(jīng)驗，準確分離出沙門氏菌，找出污染源，降低感染此病菌的潛在危險。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源

大連海關技術中心PTC—T542乳粉中沙門氏菌能力驗證樣品：凍干粉PTC213和PTC221；沙門氏標準菌株。傷寒沙門氏（FSCC215009(CMCC(B)50071)）標準菌株，將此傷寒沙門氏標準菌復蘇后用瓷珠保存于-18 ℃冰箱，此標準菌株的本實驗室編號為WB1，本次實驗取一株編號為WB1的標準菌珠進行復蘇做陽性對照實驗用（實驗編號為：WB1-2A）。

1.2 儀器與試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）和沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，以上試劑均來自廣州陸橋；沙門氏菌O多價血清（A-F）（寧波天潤，批號20210101）；生化培養(yǎng)箱；生物安全柜等。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理與預增菌

本次能力驗證樣品為采用西林瓶包裝的凍干粉，來樣編號分別為PTC213、PTC221。根據(jù)指導書說明，用75%的滅菌酒精棉球擦試西林瓶外包裝，小心開啟西林瓶，先用3 mL滅好菌的0.85%的生理鹽水對西林瓶中的干粉進行水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，用生理鹽水反復沖洗西林瓶，共收集清洗液25 mL，加入225 mL BPW，進行預增菌。同時取一株本實驗室標準儲存菌珠進行復蘇，同步進行實驗，作陽性對照。將以上測試樣品輕輕搖勻分別標注為PTC213、PTC221、WB1-2A，置于（36±1）℃的培養(yǎng)箱中，預增菌8～18 h，8 h后每隔1 h觀察增菌液的變化，并分別在8 h、12 h、16 h、18 h分別進行一次增菌培養(yǎng)及后續(xù)實驗，從分離在選擇性培養(yǎng)基上的目標菌生長性情況來看，前增菌16～18 h的結果比較理想，接下來的實驗結果均取自前增菌18 h的緩沖液作為最終結果。

1.3.2 選擇性增菌

輕搖盛裝編號為PTC213，PTC221及WB1-2A BPW緩沖液的三角瓶，分別吸1 mL培養(yǎng)混合物加入10 mL SC和10 mL TTB中，將SC置于（36±1）℃的 培 養(yǎng) 箱；TTB置于（42±1）℃培養(yǎng) 箱，培 養(yǎng)（18～24）h。培養(yǎng)24 h菌液均有輕微的渾濁現(xiàn)象。

1.3.3 劃線分離

分別用3 mm的接種環(huán)取一環(huán)SC的培養(yǎng)物分別劃線于一個BS平板和一個沙門氏顯色平板和一個XLD平板；TTB中的培養(yǎng)物做同樣操作。置于（36±1）℃培養(yǎng)箱，BS平板培養(yǎng)40～48 h，沙門氏顯色平板和XLD平板培養(yǎng)18～24 h。結果如表1及圖1所示。

表1 選擇性增菌液SC中分離在各平板上的菌落形態(tài)表

圖1 沙門氏菌典型菌落在各選擇性培養(yǎng)基上的圖示

1.3.4 純培養(yǎng)及生化實驗

（1）挑取PTC213選擇性培養(yǎng)基上①②③（圖1 圖片中序號）所描述的典型菌落3個分別接種三糖鐵（生化反應現(xiàn)象如圖2示）及營養(yǎng)瓊脂做純培養(yǎng)，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，挑24 h內(nèi)新鮮純培養(yǎng)的菌落做相應的生化實驗和血清學鑒定（生化實驗按陸橋干制生化鑒定試劑盒操作說明書進行操作）。

（2）對PTC221選擇性培養(yǎng)基上Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所描述的典型菌落及WB1-2A標準菌株同步進行如（1）中試驗操作。結果描述如表2、圖2；各生化反應結果列舉如表3所示。

2 結果與分析

由以上實驗得出結果如表2、圖2所示，結合表3 生化反應現(xiàn)象，依照《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）[1]中表2、 表3得 出：PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅰ號 為A3型可疑沙門氏，依照國標ONPG的生化反應應為陰性，本實驗得出ONPG為陽性，血清實驗為自凝菌落，可判為非沙；依照GB4789.4—2016表2可得出PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅲ和PTC213+BPW+TTB—③為非沙；PTC213+BPW+TTB－①/②及WB1-2A標準菌株生化反應現(xiàn)象完全符合典型沙門氏生化現(xiàn)象，結合血清學鑒定判定為沙門氏檢出。

表2 可疑菌落在三糖鐵上呈現(xiàn)的結果表

圖2 可疑菌落在三糖鐵上呈現(xiàn)的圖示

表3 生化現(xiàn)象及結果判定表

3 要點分析

3.1 關于預增菌和增菌

隨著現(xiàn)代方便食品的盛行，食品加工工藝也隨之變化，而食品加工過程中的加熱、干燥、冷凍、機械處理等加工工藝使得沙門氏菌細胞膜遭到了不同程度的損傷，使其處于比較弱的活性或瀕死狀態(tài)，緩沖蛋白胨水（BPW）具有較高的pH緩沖體系且為非選擇性培養(yǎng)基，有助于修復受損的細胞膜，還能復蘇處于冷凍休眠狀態(tài)的細菌，但同時其他雜菌也同樣得到修復與生長，雜菌太多往往會掩蓋住目標菌，因此控制好預增菌的時間是非常關鍵的一個程序。

選擇性增菌液會促進相應種群的沙門氏菌生長，同時抑制其他菌落的生長，而目前已知的沙門氏菌血清分型已有2 500多種[2]，因此沙門氏菌選擇性增菌液最好多選擇幾種增菌液進行增菌，本文按國標 GB 4789.4—2016中的方法分別選擇TTB和SC兩種增菌液進行增菌，本次能力驗證試驗中編號為PTC213的樣品，自SC增菌液中分離在3種選擇性培養(yǎng)基上均無菌落生長，自TTB增菌液中分離在沙門氏顯色及XLD培養(yǎng)基上均有典型菌落生長。如果本次實驗只選擇一種增菌液進行增菌，就會造成沙門氏漏檢的可能性。SC比較適合傷寒沙門氏菌的生長，而對其他沙門氏菌具有抑制的作用。從本實驗結果來看，本實驗室標準儲備菌株在SC中生長良好，三糖鐵上表現(xiàn)為不發(fā)酵糖不產(chǎn)氣，產(chǎn)少量的硫化氫，符合典型的傷寒沙門氏菌生化反應特征，而本次能力驗證試驗PTC213檢出沙門氏菌雖然生化反應與典型沙門氏菌生化完全吻合，但是其在BS上完全不生長，周正等[3]研究用鼠傷寒沙門氏和傷寒水氏在BS上均生長良好，另外其在三糖鐵上有大量的H2S產(chǎn)出，由此可以排除編號PTC213檢出沙門氏菌為非鼠傷寒沙門氏、非傷寒沙門氏，具體哪種沙門氏菌還需要進一步研究。

3.2 關于生化實驗

（1）關于商品化生化配套試劑盒。本實驗室連續(xù)10年均采用廣州陸橋的生化試劑盒作為生化鑒定的方法，從驗證實驗結果來看，目前還比較滿意，需要注意以下4點。①菌懸液的濃度不要太高，太高容易引起假陽性。②由于各個生化孔是連在一起的，加液和取放均要小心，避免因加液及晃動的過程中引起試劑間的交叉污染，從而造成結果偏差。③按照說明書進行操作并注意額外添加物的添加量及培養(yǎng)時間。④選擇純培養(yǎng)24 h左右的新鮮菌苔進行生化及血清學試驗，因為此時的菌落處于活躍期，生化反應最為靈敏。

（2）關于檢測方法的討論。目前對沙門氏的檢驗有實時熒光PCR方法、酶聯(lián)免疫（ELISA）方法、人工培育等方法[4-5]。食品中的微生物需要在一定條件和一定的機制下產(chǎn)生腸毒素或是代謝產(chǎn)物或是其繁殖生長到一定的量才能引起人或動物的中毒或疾病，這就要求這些病菌具有一定的活性，人工培育的方法檢測的準確率是目前各方法中最好的，但需要檢測人員具有豐富的經(jīng)驗，而目前PCR及ELISA方法已經(jīng)得到較好的發(fā)展，但對實驗室環(huán)境要求較高，對基礎實驗來說實現(xiàn)的難度也比較大，因而在有關致病菌檢測研究的文章中稱經(jīng)典的細菌培養(yǎng)方法是致病菌檢測的金標準[4]。

3.3 關于菌體抗原的要點分析

GB 4789.4—2016中要求，血清學分型為選做項目本次試驗不做考究，對沙門氏血清鑒定中的菌體抗原：首先排除自凝現(xiàn)象，再進行相應的血清抗原實驗[6]。

（1）O多價抗原。多數(shù)沙門為O抗原，在O多價血清中有明顯的沙粒狀凝集現(xiàn)象，如果O多價不凝也不能輕易放棄，尤其選擇性培養(yǎng)基典型菌落特征明顯，生化現(xiàn)象也符合的情況下，此時需排除是否因莢膜的原因?qū)е翺多價不凝，可將菌苔接種在高瓊脂含量的培養(yǎng)基（2%～5%），反復進行試驗，目的因菌株在高瓊脂含量的培養(yǎng)基上，莢膜發(fā)育不良，這樣反復培養(yǎng)就可以破壞其莢膜，暴露其菌體抗原，本次試驗PTC213+BPW+TTB－①號菌就是這種情況，在接種3%瓊脂含量的培養(yǎng)基做二次純培養(yǎng)后，O多價血清出現(xiàn)了明顯的凝集現(xiàn)象。

（2）Vi抗原的排除。Vi抗原又稱表面抗原，目前已知的存在Vi抗原的沙門氏有傷寒、丙型副傷寒、都柏林沙門氏菌[7]。當Vi抗原存在于細菌表面，阻止了O多價血清的凝聚時，應挑取菌苔于1 mL的生理鹽水中制成濃度高的菌懸液，在沸水中煮沸 10～60 min后，再進行O多價血清凝聚實驗。

（3）多價H抗原。H抗原又稱鞭毛抗原，大部分沙門氏都周身鞭毛，H抗原發(fā)育不良會造成H抗原血清不凝集，國標中采用接種菌體至半固體中做純培育，使鞭毛生長良好后再進行H抗原的試驗，由于血平板營養(yǎng)更豐富，本人通過多次試驗發(fā)現(xiàn)點種哥倫比亞血平板的方法，其鞭毛生長更加迅速旺盛，試驗效果更好。