膝骨關(guān)節(jié)炎實驗動物模型現(xiàn)狀研究進(jìn)展

李書博，陳 赫，孫 云，魏敏章，宋坤玉，尹宏兵，崔鎮(zhèn)海

（1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2. 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院，長春 130117）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種因過度勞損、外傷、不良體位、體質(zhì)量過重等原因引起的慢性、退行性骨關(guān)節(jié)病，基本病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨變性和丟失、滑膜增厚、韌帶和關(guān)節(jié)囊病變以及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨質(zhì)再生[1-4]，臨床上主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)僵硬、活動受限甚至關(guān)節(jié)畸形等。雖然最新研究[5]提出應(yīng)按照患者個人情況及癥狀、體征等采用具體的治療方案，以提升個人生活質(zhì)量。但實際上因為KOA的病因病機(jī)非常復(fù)雜，目前不能完全解釋，早期的診斷尚不成熟，而常用的西藥治療絕大多數(shù)為非甾體抗炎藥，長期服用會產(chǎn)生胃腸道出血、穿孔、甚至心血管疾病等不良反應(yīng)，某些程度上阻礙了其臨床應(yīng)用[6-7]。所以現(xiàn)階段中西醫(yī)治療仍以緩解癥狀、減緩病情發(fā)展為主。鑒于以上情況，以人為研究對象多有不便甚至違背倫理道德，因此通過創(chuàng)建簡便可行的KOA動物模型，用以發(fā)掘KOA的發(fā)病機(jī)制、尋找合理有效的診療和預(yù)防方法成為研究 KOA的必經(jīng)之路。

1 動物模型選擇

科研人員在造模之前首先考慮的問題就是實驗動物的選擇。因為動物實驗的最終目標(biāo)是運用到臨床，作用到人體，所以首先要考慮所選動物基因與人類基因是否相似。其次是生理結(jié)構(gòu)、基礎(chǔ)代謝、疾病特點是否與人類相似。最后是所選動物是否容易飼養(yǎng)、費用、倫理問題等。把上述問題歸結(jié)到一起再進(jìn)行綜合選擇。

1.1 小型動物模型

1.1.1 小鼠 小鼠基因組測序中蛋白質(zhì)編碼基因與人類相似度較高[8]，故可作為基因技術(shù)的常用模型，且適應(yīng)能力較強(qiáng)，容易獲取，費用較低。但不足之處是小鼠體型較小，在對膝關(guān)節(jié)進(jìn)行操作時多有不便。

1.1.2 大鼠 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨及滑膜的損傷與其他動物相比更迅速，病程變化較短，也常用于基因技術(shù)的造模，不足之處與小鼠一樣，由于體型較小，膝關(guān)節(jié)也較小，對手術(shù)操作要求較高。

1.1.3 豚鼠 豚鼠與人類KOA組織病理學(xué)類似，且性格溫順，常常久坐不動，因為身體結(jié)構(gòu)的原因，隨著年齡逐漸增加，5月齡會逐漸形成自發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎[9]。因此常用來作為自發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎模型。

1.2 中、大型動物模型

1.2.1 兔 兔的體型與鼠類相比較大，膝關(guān)節(jié)除髕骨外，大體與人類似，且在形態(tài)學(xué)方面其關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)亦與人軟骨修復(fù)相似[10]，因此是手術(shù)操作及關(guān)節(jié)固定法等的理想模型。但由于兔的膝關(guān)節(jié)幾乎總是處于屈曲形態(tài)，在生物力學(xué)上與人類不同，所以不適合功能性研究。

1.2.2 狗 狗的膝關(guān)節(jié)腔較大，更易于作為手術(shù)及操作的模型，且造模成功率比小型動物要高。另外，狗消化系統(tǒng)中的胃腸道與人類相似，因此可以作相應(yīng)研究[11]。但是購買及飼養(yǎng)費用較高，術(shù)后抗感染能力較小型動物相比較低。

1.3 其他動物

如豬、馬、羊、獼猴等，其關(guān)節(jié)腔更大，更容易手術(shù)操作，尤其是獼猴，這種動物與人類在形態(tài)、生理、病理等方面有很高的相似性，因而被用來研究各種與人類相關(guān)的疾病[12]。但考慮到費用昂貴，術(shù)后護(hù)理要求較高，且在倫理方面?zhèn)涫軤幾h，因此在實驗中運用較少。

2 造模方法分類

KOA造模方法一般分為以下2種：一種是自發(fā)性動物造模，指沒有人類干預(yù)而自然產(chǎn)生；另一種是誘發(fā)性動物造模，指通過人為注射藥物、手術(shù)誘導(dǎo)等產(chǎn)生。

2.1 自發(fā)性動物造模

2.1.1 天然自發(fā)性動物造模 天然自發(fā)性KOA模型，是指隨著生長發(fā)育的進(jìn)程，關(guān)節(jié)軟骨自行退變、老化形成 KOA。目前，常用的實驗動物主要有豚鼠[9]、STR/ort小鼠[13]等。陳松等[14]將3月齡豚鼠飼養(yǎng)2個月后建立自發(fā)性豚鼠KOA模型，通過病理切片發(fā)現(xiàn)造模后的5月齡豚鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下成骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞發(fā)生明顯改變。此造模方法受外界干擾因素少而且成功率比較高，在研究原發(fā)性KOA方面具備獨特優(yōu)勢。缺點是自發(fā)過程所需周期較長，與其相對應(yīng)的費用也較高，這也是實驗中的弊端。

2.1.2 轉(zhuǎn)基因動物造模 轉(zhuǎn)基因KOA動物模型是應(yīng)用基因技術(shù)把外源基因插入動物基因組中，并使之在動物體內(nèi)表達(dá)，或者突變、敲除動物自身基因組中某些基因造成基因缺陷，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生異常變化[15]?，F(xiàn)階段常用的轉(zhuǎn)基因動物模型是小鼠，其主要優(yōu)點是易于進(jìn)行遺傳修飾[16]。于斐等[17]基因敲除小鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1），通過激活VEGF/AKT 通路加重骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變，與手術(shù)橫斷前交叉韌帶加內(nèi)側(cè)半月板切除法相比膝關(guān)節(jié)表面軟骨毀損更嚴(yán)重，表面發(fā)生斷裂，甚至出現(xiàn)軟骨層缺失。轉(zhuǎn)基因技術(shù)優(yōu)點主要是避免手術(shù)創(chuàng)傷對實驗帶來的的影響，提高造模成功率，但是缺點也特別明顯：目前此技術(shù)尚不成熟、造模成本較高、且不同動物基因亦不同。由于病毒載體存在潛在的致瘤性等問題及非病毒載體較低的軟骨轉(zhuǎn)染效率，限制了其應(yīng)用于臨床，因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于人體還需要更多的臨床前研究[18]。

2.2 誘發(fā)性動物造模

2.2.1 非手術(shù)造模

2.2.1.1 關(guān)節(jié)腔藥物注射 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射法是將藥物注射進(jìn)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)誘導(dǎo)KOA的方法，所用藥物有膠原酶、碘乙酸鹽、尿激酶型纖溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、菲律賓菌素等，其中木瓜蛋白酶、碘乙酸鈉和膠原酶使用最為廣泛。

木瓜蛋白酶可分解軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖，使基質(zhì)對軟骨的保護(hù)能力降低，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞更易被破壞，同時軟骨降解后碎屑進(jìn)入滑液，刺激滑膜使其產(chǎn)生炎癥，加快軟骨破壞[19]。湯小康等[20]采用4%的木瓜蛋白酶對大鼠雙膝關(guān)節(jié)腔進(jìn)行注射。造模2周后將造模組與空白組大鼠對比發(fā)現(xiàn)前者雙膝關(guān)節(jié)腫脹、行動不便，X線片可見非常顯著的雙膝關(guān)節(jié)面間隙狹窄，脛骨、股骨關(guān)節(jié)面磨損，關(guān)節(jié)邊緣增生等異常表現(xiàn)。另外，模型的損傷程度與木瓜蛋白酶注射濃度呈正相關(guān)[21]，使用10%木瓜蛋白酶混合液6周即可制造出重度膝骨關(guān)節(jié)炎模型。注射木瓜蛋白酶優(yōu)點是對模型創(chuàng)傷小，所需時間短，造模成功率高。缺點是不同模型所需濃度亦不同，因此劑量較難掌握。

碘乙酸鈉（MIA）是目前OA關(guān)節(jié)腔注射最常用的化合物[22]，通過抑制Krebs循環(huán)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，引起軟骨基質(zhì)改變、軟骨降解丟失、滑膜炎癥等病理改變。鮑哲明等[23]將8周齡雄性Wistar大鼠膝關(guān)節(jié)注射MIA 2周后發(fā)現(xiàn)，大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)部分軟骨缺失，軟骨表面不規(guī)則，屬于OA疾病中期的病理表現(xiàn)。而在造模 4 周后可見關(guān)節(jié)表面軟骨大量缺損，軟骨下骨質(zhì)裸露，關(guān)節(jié)周圍可見大量骨贅出現(xiàn)，屬于晚期的 OA 程度。此方法操作簡單、對操作者技術(shù)要求低，但碘乙酸鈉屬于毒性抑制劑，容易造成大量軟骨細(xì)胞凋亡，容易對實驗造成影響。

膠原蛋白酶作用的具體機(jī)制是其能水解關(guān)節(jié)腔內(nèi)肌腱、韌帶、半月板等組織中的膠原纖維，造成動物內(nèi)側(cè)膝關(guān)節(jié)脫位，引發(fā)膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定[24]。Jeong等[25]將膠原蛋白酶注入大鼠關(guān)節(jié)腔進(jìn)行造模，12 d后發(fā)現(xiàn)滑膜液中IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子分泌明顯增多，病理組織切片顯示滑膜表面受到損傷，軟骨蛋白聚糖減少，纖維組織排布散亂。相對于木瓜蛋白酶，膠原蛋白酶具有較高的特異性，故有藥物用量少，方法簡便、周期短等優(yōu)勢[10]。

關(guān)節(jié)注射法更加簡單、便捷、高效，但此方法的缺點是藥物劑量很難把握，相對誤差較大等，容易給實驗結(jié)果帶來影響。例如大劑量、高濃度的木瓜蛋白酶進(jìn)入血液循環(huán)中，會導(dǎo)致肺部溶血從而使實驗動物死亡[26]。

2.2.1.2 關(guān)節(jié)固定法 是指將關(guān)節(jié)強(qiáng)制固定于一定體位，按照固定方式可分為屈曲位固定和伸直位固定。屈曲位固定原理是限制動物模型關(guān)節(jié)運動造成關(guān)節(jié)周圍肌肉韌帶及關(guān)節(jié)軟骨萎縮，從而使關(guān)節(jié)軟骨等組織發(fā)生萎縮性變化[27]。田育魁等[28]用改良屈曲位固定法將實驗新西蘭大白兔固定于屈曲位，造模8周后取膝關(guān)節(jié)部分組織，在光鏡下看到膠原纖維不同程度增多且順序比較混亂，關(guān)節(jié)軟骨局部表面可見裂隙等。伸直位固定原理改變關(guān)節(jié)周圍的應(yīng)力而產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨退變[27]。何業(yè)文等[29]通過改良伸直位固定法對新西蘭大白兔進(jìn)行造模，在第2周和第6周分別解剖模型，并制成切片，經(jīng) HE 染色等方法觀察結(jié)果后發(fā)現(xiàn)固定時間與關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且動物模型都出現(xiàn)不同程度的軟骨細(xì)胞減少及軟骨退變，且大大減少了造模時間。因為伸直位固定導(dǎo)致的KOA和臨床上發(fā)病機(jī)制比較接近，故在實驗中應(yīng)用更為廣泛[30]。綜上所述，關(guān)節(jié)固定法是一種操作簡單、實驗過程可控、成功率高的造模方法，在保證造模效果的同時，避免了手術(shù)和藥物對關(guān)節(jié)腔內(nèi)結(jié)構(gòu)的影響及破壞。不足之處關(guān)節(jié)固定法造模相關(guān)并發(fā)癥較多，主要包括遠(yuǎn)端肢體血運障礙、動物一般情況差等[31]。

2.2.2 手術(shù)造模

2.2.2.1 傳統(tǒng) Hulth法及改良 Hulth法 Hulth法是目前常用建立KOA模型的實驗方法之一。傳統(tǒng)的Hulth手術(shù)造模方式為將模型手術(shù)麻醉后切斷前交叉韌帶、后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，并切除內(nèi)側(cè)半月板[32]，即通過打破關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，使關(guān)節(jié)面直接摩擦從而形成KOA，傳統(tǒng)的 Hulth法建模更接近于現(xiàn)在臨床上中晚期的KOA。周麗等[33]運用此方法，4周后造模成功。此建模效果得到了廣泛認(rèn)可，但也存在一些問題，如手術(shù)創(chuàng)口較大、切除交叉韌帶后膝關(guān)節(jié)極不穩(wěn)定，易導(dǎo)致脫位，從而影響了實驗的不確定性。因此，廣大學(xué)者在傳統(tǒng)Hulth手術(shù)建模方式的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改良，李滔等[12]運用改良Hulth法手術(shù)造模，即將動物模型手術(shù)麻醉后切斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，切除前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板，保留后交叉韌帶，并在股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)面切除部分軟骨。6個月后看到關(guān)節(jié)軟骨及滑膜等組織明顯退變。與傳統(tǒng)Hulth法比較，改良Hulth法對模型造成的手術(shù)創(chuàng)傷較小，成功率較高，數(shù)據(jù)可靠，是目前手術(shù)誘導(dǎo)KOA模型的經(jīng)典方法。但是，對術(shù)者的操作、無菌技術(shù)及術(shù)后護(hù)理更加嚴(yán)格，此造模方法適用于早、中期膝骨關(guān)節(jié)炎研究。

2.2.2.2 前交叉韌帶切斷術(shù)（ACLT） 前交叉韌帶切斷術(shù)（ACLT）也是學(xué)者們現(xiàn)階段建立KOA模型的常用方法之一，與Hulth法不同的是，ACLT是將實驗動物麻醉后，在膝關(guān)節(jié)髕旁處取一切口，只將前交叉韌帶進(jìn)行切斷，通過打破關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)定性來誘導(dǎo)軟骨退變[34]。Tawonsawatruk 等[35]通過ACLT 對大鼠造模，分別于4周、8周、12周進(jìn)行組織病理學(xué)評分，得出結(jié)論，造模組明顯高于對照組；12周后HE染色顯示造模組軟骨細(xì)胞減少且分布不均。此方法具有操作簡單、結(jié)構(gòu)破壞小的優(yōu)勢，但不足之處是由于對膝關(guān)節(jié)應(yīng)力破壞較小，導(dǎo)致誘導(dǎo)的模型病變進(jìn)程較緩慢。

2.2.2.3 半月板部分或全部切除術(shù)（MMT） 半月板部分或全部切除術(shù)（MMT）即將實驗動物麻醉后，切除部分或全部半月板，導(dǎo)致模型膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性下降、加大關(guān)節(jié)面摩擦，從而加重磨損。Parrish 等[36]采用 MMT 對大鼠進(jìn)行KOA 造模，且術(shù)后不限制活動，3周后組織病理染色結(jié)果顯示模型關(guān)節(jié)軟骨鈣化，軟骨下骨硬化及骨贅形成。此方法對動物模型造成的創(chuàng)傷小，與ACLT相比，造模時間短，結(jié)果穩(wěn)定可靠，但仍對關(guān)節(jié)有創(chuàng)傷，適用于研究創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的病因病機(jī)，常與ACLT聯(lián)用造模。

2.2.2.4 卵巢切除法 卵巢切除法是通過手術(shù)將雌性動物卵巢切除，降低雌激素水平，而骨量流失或者骨質(zhì)疏松的大部分原因都是因為雌激素缺乏[37]，因此雌激素可能對膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展及病變具有抑制作用[38]。譚啟釗等[39]將6只雌性 SD 大鼠在手術(shù)前 12 h 禁食，麻醉后減掉卵巢，術(shù)后每天注射抗生素連續(xù)注射 3 d，預(yù)防術(shù)后感染。8周后通過關(guān)節(jié)軟骨組織切片發(fā)現(xiàn)軟骨下骨微觀結(jié)構(gòu)的改變顯著增高。此方法涉及的手術(shù)操作比較復(fù)雜，局限性較高，僅適用于雌性動物，且造模所需時間長。因此，僅適用于女性絕經(jīng)、骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究。

3 討論

動物模型的研究是進(jìn)行臨床KOA病因病機(jī)、治則治法、方藥選擇、日常保健等研究的重要基礎(chǔ)。因此，在選擇動物模型前，需要綜合考慮各個模型的生理特性、經(jīng)費預(yù)算、實驗?zāi)康牡仍龠M(jìn)行造模。造模方法多種多樣，但各有利弊：1）自發(fā)性造模受到創(chuàng)傷、藥物等其他因素干擾較少，但造模時間較長；2）基因技術(shù)成功率較高，但此技術(shù)尚不成熟，發(fā)展?jié)摿薮螅?）藥物注射操作相對簡單，造模成功率相對較高，對模型造成的傷害較少，但藥物劑量難以把控；4）手術(shù)造模時間短，成功率高，但對手術(shù)操作要求較高，術(shù)后護(hù)理要求也高等等。同時應(yīng)緊跟學(xué)科前沿，隨著時代的發(fā)展不斷開創(chuàng)出新的動物模型和造模方法，最終應(yīng)用于臨床診斷與治療。